用于鉴定新型药物和药物靶标的高通量筛选系统的制作方法

背景技术：

0、2.背景技术

1、免疫疗法是治疗癌症的强有力的治疗方法。然而，其应用受到限制，因为检查点阻断免疫疗法对许多患者，特别是实体瘤患者不起作用。一些内在和外在因素被认为导致耐药性，包括信号传导通路的改变、免疫抑制性肿瘤微环境以及有效t细胞向肿瘤微环境的浸润不良。研究人员已尝试通过研究癌症患者的药物反应机制和临床结局，以及通过开发新型疗法用于对现有免疫疗法无缓解或低反应的患者来克服这些局限性。然而，该领域的研究一直很困难，因为传统上用于筛选药物反应和免疫识别的基于细胞的测定系统并不普遍适用于各种癌症和/或免疫效应细胞类型。传统的高通量筛选系统对于大规模研究而言并不是最佳选择，因为它们需要从遗传相同的同基因小鼠模型制备免疫细胞和癌症模型。此外，使用二维(2d)细胞培养物无法重现肿瘤微环境，因为2d细胞培养物引起细胞和细胞外环境之间相互作用的干扰以及细胞形态、极性和分裂方法的变化。

2、因此，需要更好的高通量测定系统以识别新型药物靶标并开发更有效的药物。

3、3.
技术实现要素：

4、本公开提供了基于细胞的高通量筛选系统，用于鉴定新型药物靶标和开发用于治疗癌症或免疫病症的药物。

5、本文提供的测定系统利用1)包含抗原结合蛋白(例如，单链可变片段(scfv))的免疫桥蛋白，其可以募集并激活特异性免疫效应细胞，例如t细胞和nk细胞，和/或2)使用rna指导的核酸酶(例如，crispr)的高通量筛选平台。

6、免疫桥蛋白是含有与免疫细胞标志物(例如t细胞上的cd3或nk细胞上的nkp46)结合的scfv分子的人工蛋白。因此，免疫桥蛋白可以与免疫效应细胞特异性相互作用。申请人证明，癌细胞上表达的免疫桥蛋白可以募集并激活免疫效应细胞，从而导致靶向杀伤癌细胞。免疫桥蛋白和免疫细胞标志物之间的相互作用使得免疫细胞和癌细胞之间的特异性和选择性相互作用重现，无论其来源如何。因此，癌细胞上表达的免疫桥蛋白可以用于诱导针对癌细胞的免疫效应细胞的激活并分析癌细胞对激活的免疫效应细胞的反应。该系统可以用于高通量筛选参与调节癌细胞对激活的免疫效应细胞的反应的药物和/或基因，从而参与免疫肿瘤学功能。

7、申请人进一步使用基于微胶囊的区室化技术将高通量筛选系统与3d肿瘤培养系统相结合。它实现多个癌症样本在单个组织培养容器中进行3d生长，而不与其他样本发生串扰。肿瘤样本的条形码化进一步实现多个样本的复用和解复用，同时实现追踪它们的身份。先前，大规模3d培养在技术上具有挑战性，费力且耗时。因此，尽管3d培养预期比传统2d癌症模型更好地重现患者肿瘤，但在高通量筛选中的使用受限制。本公开采用基于微胶囊的3d培养系统，该系统克服这些限制并能够同时培养和分析复用的肿瘤样本，其中每个癌症样本均带有条形码。

8、在3d培养系统中，将癌细胞包封在微胶囊中，在那里它们可以生长成球形肿瘤。可以将包封在单独的微胶囊群中的几种癌症样本合并在单个组织培养容器中并培养。培养后，可以从微胶囊中收集肿瘤样本，并提取和分析其基因组dna，以表征培养物中剩余的癌细胞，例如，通过对dna条形码、crispr系统中的sg rna序列进行测序等。该系统从根本上解决了传统系统的可扩展性限制，并通过极大简化耗时费力的过程，使3d肿瘤中的药物测试和crispr功能基因组学成为可能。

9、因此，本公开提供了免疫桥蛋白，其从n端至c端包含：a.针对免疫细胞标志物的scfv，b.跨膜结构域，c.胞质结构域，和d.报告结构域，任选地其中该报告结构域是荧光蛋白。

10、在一些实施方案中，免疫细胞标志物是t细胞或nk细胞的细胞表面蛋白。在一些实施方案中，免疫细胞标志物是cd3。在一些实施方案中，免疫细胞标志物是nkp46。在一些实施方案中，跨膜结构域是b7的跨膜结构域。在一些实施方案中，胞质结构域是b7的胞质结构域。

11、在一些实施方案中，免疫桥蛋白进一步包含在免疫桥蛋白的细胞内或细胞外部分中用于免疫染色的表位，任选地其中该表位选自ha表位和v5表位。在一些实施方案中，免疫桥蛋白进一步包含位于免疫桥蛋白的n端的信号肽，任选地h7信号肽。在一些实施方案中，免疫桥蛋白进一步包含在免疫桥蛋白的细胞外部分中的人igg1的铰链-ch2-ch3区。

12、本公开还提供了免疫桥多核苷酸，其编码本文所述的免疫桥蛋白。它还提供了免疫桥载体，其包含编码本文所述的免疫桥蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，载体是病毒载体或质粒。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。

13、一方面，本公开提供了靶向文库，其包含多个靶向文库构建体，其中该靶向文库构建体中的每一个包含编码靶向多个基因组靶位点中的一个的sgrna的sgrna编码序列。在一些实施方案中，每个靶向文库构建体进一步包含条形码序列。

14、在一些实施方案中，多个靶向文库构建体包含编码共靶向人基因组中超过10,000个位点的sgrna的sgrna编码序列。在一些实施方案中，多个靶向文库构建体包含编码共靶向人基因组中超过15,000个位点的sgrna的sgrna编码序列。在一些实施方案中，多个靶向文库构建体包含编码共靶向人基因组中超过20,000个位点的sgrna的sgrna编码序列。在一些实施方案中，多个靶向文库构建体包含编码共靶向人基因组中超过50,000个位点的sgrna的sgrna编码序列。在一些实施方案中，多个靶向文库构建体包含编码共靶向人基因组中超过100,000个位点的sgrna的sgrna编码序列。

15、在一些实施方案中，每个靶向文库构建体包含一对唯一的sgrna编码序列和条形码序列。

16、在一些实施方案中，每个靶向文库构建体进一步包含核酸内切酶的编码序列。在一些实施方案中，核酸内切酶是成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)相关蛋白、锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应核酸酶(talen)或大范围核酸酶(mn)。

17、在一些实施方案中，核酸内切酶是cas9。在一些实施方案中，每个靶向文库构建体是病毒载体或质粒。在一些实施方案中，每个靶向文库构建体是慢病毒载体。

18、另一方面，本公开提供了细胞群，其中该群中的至少多个细胞包含本文所述的靶向文库构建体，其中该细胞群共包含多种类型的靶向文库构建体。在一些实施方案中，该细胞群进一步包含本公开的免疫桥蛋白。在一些实施方案中，该细胞群包含本公开的免疫桥多核苷酸或免疫桥载体。

19、在一些实施方案中，细胞是癌细胞。在一些实施方案中，细胞是一种或多种癌细胞系。在一些实施方案中，该细胞群包含多个细胞系，其中每个细胞系在靶向文库构建体或免疫桥多核苷酸上包含唯一的细胞系特异性条形码。在一些实施方案中，细胞是原代癌细胞。在一些实施方案中，细胞是来自一名或多名癌症患者的原代癌细胞。在一些实施方案中，该细胞群包含来自多名癌症患者的原代癌细胞，其中来自单个癌症患者的细胞在靶向文库构建体或免疫桥多核苷酸上包含唯一的患者特异性条形码。在一些实施方案中，细胞是实体瘤细胞。

20、在一些实施方案中，细胞已用本公开的免疫桥多核苷酸、免疫桥载体或靶向文库转染。在一些实施方案中，细胞已用本文提供的免疫桥多核苷酸或免疫桥载体，以及靶向文库转染。

21、在一些实施方案中，该细胞群进一步包含靶向文库构建体或免疫桥多核苷酸编码的标志物蛋白。在一些实施方案中，标志物蛋白是荧光素酶。在一些实施方案中，该细胞群进一步包含外源核酸内切酶。在一些实施方案中，核酸内切酶是成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)相关蛋白、锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应核酸酶(talen)或大范围核酸酶(mn)。在一些实施方案中，核酸内切酶是cas9。在一些实施方案中，该群中的至少多个细胞包含本文所述的免疫桥蛋白。

22、本公开的一方面提供了微胶囊池，其包封本公开的细胞群。在一些实施方案中，每个微胶囊包封包含相同条形码序列的细胞群的子集。在一些实施方案中，相同条形码序列是细胞系特异性条形码或患者特异性条形码的序列。在一些实施方案中，每个微胶囊包封从同一受试者获得的细胞群的子集。在一些实施方案中，每个微胶囊包封从同一癌症患者获得的细胞群的子集。在一些实施方案中，每个微胶囊包封从单个细胞系获得的细胞群的子集。

23、在一些实施方案中，每个微胶囊包封包含两个或更多个不同条形码序列的细胞群的子集。在一些实施方案中，两个或更多个不同条形码序列是细胞系特异性条形码或患者特异性条形码的序列。在一些实施方案中，每个微胶囊包封从两名或更多名受试者获得的细胞群的子集。在一些实施方案中，每个微胶囊包封从两名或更多名癌症患者获得的细胞群的子集。在一些实施方案中，每个微胶囊包封从两个或更多个细胞系获得的细胞群的子集。

24、在一些实施方案中，微胶囊池进一步包封免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含nk细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含树突细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含巨噬细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含外周血单核细胞(pbmc)。

25、在一些实施方案中，微胶囊池在培养基中孵育。在一些实施方案中，细胞群形成3d肿瘤类器官。

26、另一方面，本发明提供了高通量筛选的方法，其包括以下步骤：a.培养细胞群或孵育本公开的微胶囊池；和b.分析从培养物获得的细胞。在一些实施方案中，分析步骤包括对从培养物获得的细胞的靶向文库构建体进行测序。在一些实施方案中，分析步骤包括对靶向文库构建体中的条形码序列进行测序。在一些实施方案中，分析步骤包括对靶向文库构建体中的sgrna的编码序列进行测序。在一些实施方案中，该方法进一步包括鉴定在培养条件下与细胞的存活或死亡相关的基因组位点的步骤。

27、在一些实施方案中，在存在免疫细胞的情况下培养细胞群。在一些实施方案中，该方法进一步包括在不存在免疫细胞的情况下培养不同细胞群的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过鉴定在培养条件下与细胞的存活或死亡相关的基因组位点来鉴定免疫-肿瘤学靶标的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括比较从存在免疫细胞的培养物获得的细胞和从不存在免疫细胞的培养物获得的细胞的步骤。

28、在一些实施方案中，该方法进一步包括通过鉴定在一种或多种培养条件下与细胞的存活或死亡相关的基因组位点来鉴定免疫-肿瘤学靶标的步骤。

29、在一些实施方案中，免疫细胞包含t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含nk细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含树突细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含巨噬细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含外周血单核细胞(pbmc)。

30、在一些实施方案中，在存在一种或多种药物的情况下培养细胞群。在一些实施方案中，在进一步存在免疫细胞的情况下培养细胞群。在一些实施方案中，该方法进一步包括在不存在一种或多种药物的情况下培养不同细胞群的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括比较从存在一种或多种药物的培养物获得的细胞和从不存在一种或多种药物的培养物获得的细胞的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过鉴定在一种或多种培养条件下与细胞的存活或死亡相关的药物来鉴定有效药物的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过鉴定在一种或多种培养条件下与细胞的存活或死亡相关的基因组位点来鉴定药物靶标的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括在不存在免疫细胞的情况下培养不同细胞群的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括比较从存在免疫细胞的培养物获得的细胞和从不存在免疫细胞的培养物获得的细胞的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过鉴定在一种或多种培养条件下与细胞的存活或死亡相关的药物来鉴定有效药物的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过鉴定在一种或多种培养条件下与细胞的存活或死亡相关的基因组位点来鉴定药物靶标的步骤。

31、在一些实施方案中，培养步骤在培养皿或多孔板中进行。在一些实施方案中，培养步骤在多个微胶囊中进行。在一些实施方案中，培养步骤在3d肿瘤类器官中进行。

32、又一方面，本公开提供了用于高通量筛选的试剂盒，其包含：a.免疫桥多核苷酸，或免疫桥载体，和b.本文提供的靶向文库。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含编码外源核酸酶的核酸酶多核苷酸。在一些实施方案中，外源核酸酶选自由成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)相关蛋白、锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应核酸酶(talen)和大范围核酸酶(mn)组成的组。在一些实施方案中，外源核酸酶是cas9。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含编码标志物蛋白的标志物多核苷酸。在一些实施方案中，标志物蛋白是荧光素酶。在一些实施方案中，核酸酶多核苷酸或标志物多核苷酸是病毒载体，任选地是慢病毒载体。

技术实现思路