NKp46结合多肽及其用途的制作方法

本发明涉及nkp46结合多肽，及使用nkp46结合多肽调节nkp46的生物活性的方法。此类方法包括但不限于治疗癌症及感染性疾病的方法。在一些实施方案中，nkp46结合多肽为融合多肽，其包含nkp46结合多肽及免疫细胞活化细胞因子和/或结合除nkp46外的抗原的多肽。

背景技术：

1、nkp46，也称为cd335、ly94同源物或ncr1，为表达于自然杀伤(nk)细胞上的活化细胞表面受体。其为一般充当受病毒感染、真菌或癌细胞上所呈现的应激配体的受体的天然细胞毒性受体(ncr)家族的部分。nkp46的连接及聚集经由其含有辅受体fcεri及cd3ζ的基于免疫受体酪氨酸的活化模体(itam)驱动活化信号，诱导干扰素-γ的表达及nk介导的细胞毒性。nkp46表达限于nk细胞且不表达于cd4+或cd8+t细胞、b细胞、单核球或颗粒球上。nkp46基因自人类至食蟹猕猴、大鼠及小鼠中的均得以保全；且这些动物中的表达模式亦限于nk细胞，正如在人类中。此表达模式及物种保全使其成为nk靶向治疗剂的理想nk特异性标记物，并且成为驱动nk介导的细胞毒性的强效nk活化受体。

2、nk细胞系能够杀死受病毒感染细胞及癌细胞而无需事先致敏且能够经由细胞因子及趋化介素信号增强树突状细胞、t细胞及b细胞的适应性免疫反应的关键免疫细胞(vidal等人curr opin virol 1(6):497-512(2011))。nk细胞具有若干识别及杀死靶细胞的机制。应激配体经由诸如nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46及dnam-1的天然细胞毒性受体(ncr)接合及活化nk细胞去颗粒。mhc i类损失为许多病毒的共同免疫逃避策略且亦在人类癌症中观测到。nk细胞可通过自kir及nkg2a撤回抑制性信号来识别及杀死不表达mhc i类的细胞(raulet及vance nat rev immunol 6(7):520-531(2006))。通过抗体对病毒或癌症抗原进行抗体调理作用可促效nk细胞上的cd16a，诱导nk细胞毒性的强效活化。nk细胞去颗粒释放细胞毒性蛋白以及免疫刺激细胞因子，诸如干扰素-γ及tnf-α；以及免疫募集趋化介素，如ccl3、ccl4、ccl5、xcl1及xcl2(fauriat等人blood 115(11):2167-2176(2010)及bottcher等人cell 172(5):1022-1037(2018))。这些分泌的因子活化且募集dc、t细胞及b细胞以调节有效适应性免疫反应。

3、许多刺激及抑制信号调节nk细胞的整体活化状态，且控制反应的临限值及量值。受病毒感染的细胞的nk介导的杀灭的理想条件需要诸如介白素-2(il-2)或介白素-15(il-15)的细胞因子的支援。il-2及il-15为经由cd122及cd132所构成的共同异二聚体信号传导受体刺激t细胞及nk细胞增殖的强效细胞因子。il-2亦可接合包括cd25的受体的异三聚体高亲和力形式。除增强nk细胞存活及增殖以外，il-2及il-15可激活nk细胞以表达在去颗粒后释放且用于破坏靶细胞的效应分子，诸如颗粒酶-b、穿孔蛋白及干扰素-γ。由感染或癌症引起的病理性炎症可使nk细胞进入耗竭及无效状态。用il-2或il-15刺激可使耗竭nk细胞再振作且战胜抑制性免疫信号。

4、需要可使分子(诸如活化分子)特异性地靶向nk细胞以增加nk细胞反应的效力及选择性的nkp46结合多肽。

技术实现思路

1、本文提供nkp46结合多肽及使用nkp46结合多肽治疗例如癌症或感染性疾病的方法。在一些实施方案中，nkp46结合多肽包含至少一个结合nkp46的vhh域。在一些实施方案中，nkp46结合多肽包含一个或多个额外结合域和/或细胞因子序列。

2、下文提供一些实施方案。

3、1.一种多肽，其包含至少一个vhh域，所述至少一个vhh域结合nkp46且包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:18、19、20或21的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:22、23、24、25、26或27的氨基酸序列的cdr3。

4、2.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:18的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:22的氨基酸序列的cdr3。

5、3.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:19的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:22的氨基酸序列的cdr3。

6、4.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:20的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:22的氨基酸序列的cdr3。

7、5.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:21的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:22的氨基酸序列的cdr3。

8、6.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:18的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:23的氨基酸序列的cdr3。

9、7.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:18的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:24的氨基酸序列的cdr3。

10、8.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:18的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:25的氨基酸序列的cdr3。

11、9.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:18的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:26的氨基酸序列的cdr3。

12、10.如实施方案1的多肽，其中至少一个vhh域包含：包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:18的氨基酸序列的cdr2；及包含seq id no:27的氨基酸序列的cdr3。

13、11.如实施方案1至10中任一例的多肽，其中至少一个vhh域或各vhh域经人源化。

14、12.如实施方案1至11中任一例的多肽，其中至少一个vhh域包含与seq id no:1-16中任一者的氨基酸序列至少85％、90％、95％或至少99％一致的氨基酸序列。

15、13.如实施方案1至12中任一例的多肽，其中至少一个vhh域包含seq id no:1-16中任一者的氨基酸序列。

16、14.如实施方案1至13中任一例的多肽，其中至少一个vhh域包含seq id no:11或15的氨基酸序列。

17、15.如实施方案1至14中任一例的多肽，其包含两个vhh域。

18、16.如实施方案1至14中任一例的多肽，其包含三个vhh域。

19、17.如实施方案1至16中任一例的多肽，其中所述多肽包含免疫细胞活化细胞因子或其功能性部分。

20、18.如实施方案17的多肽，其中所述免疫细胞活化细胞因子与结合nkp46的vhh域的n端或c端融合。

21、19.如实施方案17或实施方案18的多肽，其中所述免疫细胞活化细胞因子为il-2、il-15、il-7、il-6、il-12、ifnα、ifnβ或ifnγ，或其减毒或经修饰型。

22、20.如实施方案1至19中任一例的多肽，其中所述多肽包含至少一个结合除nkp46外的抗原的抗原结合域。

23、21.如实施方案20的多肽，其中所述多肽包含至少一个结合肿瘤抗原的抗原结合域。

24、22.如实施方案20或21的多肽，其中所述多肽包含至少一个结合选自以下的抗原的抗原结合域：1-92-lfa-3、5t4、α-4整合素、α-v整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、agr2、抗lewis-y、apelin j受体、april、b7-h3、b7-h4、b7-h6、baff、bcma、btla、c5补体、c-242、ca9、ca19-9、(lewis a)、碳酸酐酶9、cd2、cd3、cd6、cd9、cd11a、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd27、cd28、cd30、cd33、cd38、cd39、cd40、cd40l、cd41、cd44、cd44v6、cd47、cd51、cd52、cd56、cd64、cd70、cd71、cd73、cd74、cd80、cd81、cd86、cd95、cd117、cd123、cd125、cd132、(il-2rg)、cd133、cd137、cd138、cd166、cd172a、cd248、cdh6、ceacam5(cea)、ceacam6(nca-90)、密连蛋白(claudin)-3、密连蛋白-4、cmet、胶原蛋白、cripto、csfr、csfr-1、ctla-4、ctgf、cxcl10、cxcl13、cxcr1、cxcr2、cxcr4、cyr61、dl44、dlk1、dll3、dll4、dpp-4、dsg1、eda、edb、egfr、egfrviii、内皮素b受体(endothelin b receptor；etbr)、enpp3、epcam、epha2、ephb2、erbb3、rsv的f蛋白、fap、fas、fcrh5、fgf-2、fgf8、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、flt-3、叶酸受体α(frα)、gal3st1、g-csf、g-csfr、gd2、gitr、glut1、glut4、gm-csf、gm-csfr、gp iib/iiia受体、gp130、gpiib/iiia、gpnmb、gprc5d、grp78、havcar1、her2/neu、her3、her4、hgf、hgh、hvem、玻尿酸酶、icos、ifnα、ifnβ、ifnγ、ige、ige受体(fceri)、igf、igf1r、il1b、il1r、il2、il11、il12、il12p40、il-12r、il-12rβ1、il13、il13r、il15、il17、il18、il21、il23、il23r、il27/il27r(wsx1)、il29、il-31r、il31/il31r、il2r、il4、il4r、il6、il6r、胰岛素受体、jagged配体、jagged 1、jagged2、kiss1-r、lag-3、lif-r、lewis x、light、lrp4、lrrc26、ly6g6d、lypd1、mcsp、间皮素、mica、micb、mrp4、muc1、黏蛋白-16(muc16、ca-125)、na/k atp酶、ngf、呆蛋白(nicastrin)、nkg2a、notch受体、notch 1、notch2、notch 3、notch 4、nov、osm-r、ox-40、par2、pdgf-aa、pdgf-bb、pdgfrα、pdgfrβ、pd-1、pd-l1、pd-l2、磷脂酰基-丝氨酸、p1gf、psca、psma、psgr、raag12、rage、slc44a4、神经鞘胺醇1磷酸(sphingosine 1phosphate)、steap1、steap2、tag-72、tapa1、tem-8、tgfβ、tgfβ受体1(tgfbr1)、tgfβ受体2(tgfbr2)、tigit、tim-3、tlr2、tlr4、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tmem31、tnfα、tnfr、tnfrs12a、trail-r1、trail-r2、转铁蛋白(transferrin)、转铁蛋白受体、trk-a、trk-b、trop-2upar、vap1、vcam-1、vegf、vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegfr1、vegfr2、vegfr3、vista、wisp-1、wisp-2及wisp-3。

25、23.如实施方案20至22中任一例的多肽，其中至少一个结合除nkp46外的抗原的抗原结合域为vhh域。

26、24.如实施方案23的多肽，其中结合除nkp46外的抗原的各抗原结合域为vhh域。

27、25.如实施方案20至22中任一例的多肽，其中至少一个结合除nkp46外的抗原的抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区。

28、26.如实施方案25的多肽，其中结合除nkp46外的抗原的各抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区。

29、27.如实施方案1至22中任一例的多肽，其中所述多肽的各vhh域结合nkp46。

30、28.如实施方案27的多肽，其中各vhh域包含相同cdr1、cdr2及cdr3氨基酸序列。

31、29.如实施方案27的多肽，其中各vhh域包含相同vhh序列。

32、30.如实施方案1至29中任一例的多肽，其中所述nkp46为人类nkp46。

33、31.如实施方案30的多肽，其中所述人类nkp46包含seq id no:29的序列。

34、32.如实施方案1至31中任一例的多肽，其中所述多肽包含fc区。

35、33.如实施方案32的多肽，其中所述fc区包含选自seq id no:53-89的氨基酸序列。

36、34.如实施方案32或实施方案33的多肽，其在生理条件下形成二聚体。

37、35.如实施方案32至34中任一例的多肽，其中所述多肽包含与所述fc区的c端融合的免疫细胞活化细胞因子。

38、36.一种复合体，其包含第一多肽及第二多肽，其中所述第一多肽为如实施方案1至35中任一例的多肽，其中所述第一多肽包含第一fc区，且其中所述第二多肽包含第二fc区，且其中所述第一fc区与所述第二fc区相同或不同。

39、37.如实施方案36的复合体，其中所述第一或所述第二多肽包含至少一个结合nkp46的vhh域、至少一个免疫细胞活化细胞因子和/或至少一个结合除nkp46外的抗原的抗原结合域。

40、38.如实施方案37的复合体，其中若结合除nkp46外的抗原的所述抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区，则所述重链可变区与包含所述第一或所述第二fc区的重链恒定区融合。

41、39.如实施方案37或38的复合体，其中所述第一或所述第二多肽包含结合选自tgfβ受体1、tgfβ受体2及nkg2a的除nkp46外的抗原的抗原结合域。

42、40.如实施方案37至39中任一项的复合体，其中所述第一或所述第二多肽包含至少一个结合肿瘤抗原的结合域。

43、41.如实施方案37至40中任一例的复合体，其中第一或所述第二多肽包含至少一个结合选自以下的抗原的结合域：1-92-lfa-3、5t4、α-4整合素、α-v整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、agr2、抗lewis-y、apelin j受体、april、b7-h3、b7-h4、b7-h6、baff、bcma、btla、c5补体、c-242、ca9、ca19-9、(lewis a)、碳酸酐酶9、cd2、cd3、cd6、cd9、cd11a、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd27、cd28、cd30、cd33、cd38、cd39、cd40、cd40l、cd41、cd44、cd44v6、cd47、cd51、cd52、cd56、cd64、cd70、cd71、cd73、cd74、cd80、cd81、cd86、cd95、cd117、cd123、cd125、cd132、(il-2rg)、cd133、cd137、cd138、cd166、cd172a、cd248、cdh6、ceacam5(cea)、ceacam6(nca-90)、密连蛋白-3、密连蛋白-4、cmet、胶原蛋白、cripto、csfr、csfr-1、ctla-4、ctgf、cxcl10、cxcl13、cxcr1、cxcr2、cxcr4、cyr61、dl44、dlk1、dll3、dll4、dpp-4、dsg1、eda、edb、egfr、egfrviii、内皮素b受体(etbr)、enpp3、epcam、epha2、ephb2、erbb3、rsv的f蛋白、fap、fas、fcrh5、fgf-2、fgf8、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、flt-3、叶酸受体α(frα)、gal3st1、g-csf、g-csfr、gd2、gitr、glut1、glut4、gm-csf、gm-csfr、gp iib/iiia受体、gp130、gpiib/iiia、gpnmb、gprc5d、grp78、havcar1、her2/neu、her3、her4、hgf、hgh、hvem、玻尿酸酶、icos、ifnα、ifnβ、ifnγ、ige、ige受体(fceri)、igf、igf1r、il1b、il1r、il2、il11、il12、il12p40、il-12r、il-12rβ1、il13、il13r、il15、il17、il18、il21、il23、il23r、il27/il27r(wsx1)、il29、il-31r、il31/il31r、il2r、il4、il4r、il6、il6r、胰岛素受体、jagged配体、jagged 1、jagged2、kiss1-r、lag-3、lif-r、lewis x、light、lrp4、lrrc26、ly6g6d、lypd1、mcsp、间皮素、mica、micb、mrp4、muc1、黏蛋白-16(muc16、ca-125)、na/k atp酶、ngf、呆蛋白、notch受体、notch 1、notch 2、notch 3、notch 4、nov、osm-r、ox-40、par2、pdgf-aa、pdgf-bb、pdgfrα、pdgfrβ、pd-1、pd-l1、pd-l2、磷脂酰基-丝氨酸、p1gf、psca、psma、psgr、raag12、rage、slc44a4、神经鞘胺醇1磷酸、steap1、steap2、tag-72、tapa1、tem-8、tgfβ、tigit、tim-3、tlr2、tlr4、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tmem31、tnfα、tnfr、tnfrs12a、trail-r1、trail-r2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、trk-a、trk-b、trop-2upar、vap1、vcam-1、vegf、vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegfr1、vegfr2、vegfr3、vista、wisp-1、wisp-2及wisp-3。

44、42.如实施方案36至41中任一例的复合体，其中所述第二多肽的至少一个vhh域或各vhh域经人源化。

45、43.如实施方案36至42中任一例的复合体，其中所述第一fc区包含杵突变且所述第二fc区包含臼突变，或其中所述第一fc区包含臼突变且所述第二fc区包含杵突变。

46、44.如实施方案43的复合体，其中所述第一fc区包含t366w突变且所述第二fc区包含t366s、l368a及y407v突变，或其中所述第一fc区包含臼突变且所述第二fc区包含杵突变。

47、45.如实施方案44的复合体，其中包含所述t366s、l368a及y407v突变的所述fc区包含h435r或h435k突变。

48、46.如实施方案36至45中任一例的复合体，其中所述多肽在生理条件下为二聚体，或其中所述复合体为在生理条件下形成。

49、47.一种免疫结合物，其包含如实施方案1至35中任一例的多肽或如实施方案36至46中任一例的复合体，及细胞毒性剂。

50、48.如实施方案47的免疫结合物，其中所述细胞毒性剂为选自卡奇霉素(calicheamicin)、奥瑞他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、微管素(tubulicin)、类美登素(maytansinoid)、念珠藻素(cryptophycin)、多卡霉素(duocarmycin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、吡咯并苯并二氮杂及烯二炔抗生素。

51、49.如实施方案47或48的免疫结合物，其中所述免疫结合物包含如实施方案36至46中任一例的复合体，且其中所述第二多肽包含至少一个结合cd3、t细胞受体(tcr)α、tcrβ、cd28、cd16、cd32a、cd64、cd89或nkg2d的结合域。

52、50.一种药物组合物，其包含如实施方案1至35中任一例的多肽、如实施方案36至46中任一例的复合体或如实施方案47至49中任一例的免疫结合物，及药学上可接受的载体。

53、51.一种经分离核酸，其编码如实施方案1至35中任一例的多肽或如实施方案36至46中任一例的复合体。

54、52.一种载体，其包含如实施方案51的核酸。

55、53.一种宿主细胞，其包含如实施方案51的核酸或如实施方案52的载体。

56、54.一种宿主细胞，其表达如实施方案1至35中任一例的多肽或如实施方案36至46中任一例的复合体。

57、55.一种产生如实施方案1至35中任一例的多肽或如实施方案36至46中任一例的复合体的方法，其包含在适合于表达所述多肽或复合体的条件下培育如实施方案53或54的宿主细胞。

58、56.如实施方案55的方法，其进一步包含分离所述多肽或复合体。

59、57.一种增加nk细胞增殖或活化的方法，其包含使nk细胞与如实施方案1至35中任一例的多肽或如实施方案36至46中任一例的复合体接触。

60、58.如实施方案57的方法，其中所述nk细胞在体外。

61、59.如实施方案57的方法，其中所述nk细胞在体内。

62、60.一种治疗癌症的方法，其包含向患有癌症或感染性疾病的受试者施用药学上有效量的如实施方案1至35中任一例的多肽、如实施方案36至46中任一例的复合体、如实施方案47至49中任一例的免疫结合物或如实施方案50的药物组合物。

63、61.如实施方案60的方法，其中所述癌症为选自：基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑及中枢神经系统癌；乳腺癌；腹膜癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(gastric cancer)(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘瘤；肾癌(kidney or renal cancer)；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞状细胞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口癌及咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌(stomachcancer)；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌；外阴癌；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)；非霍奇金氏淋巴瘤；b细胞淋巴瘤；低恶性度/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)；小淋巴球性(sl)nhl；中恶性度/滤泡性nhl；中恶性度弥漫性nhl；高恶性度免疫母细胞性nhl；高恶性度淋巴母细胞性nhl；高恶性度小型无裂隙细胞nhl；巨瘤症nhl(bulky disease nhl)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；aids相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症(waldenstrom'smacroglobulinemia)；慢性淋巴球性白血病(cll)；急性淋巴母细胞性白血病(all)；急性骨髓性白血病(aml)；毛细胞白血病；及慢性骨髓母细胞性白血病。

64、62.如实施方案60或61的方法，其进一步包含施用额外治疗剂。

65、63.如实施方案62的方法，其中所述额外治疗剂为抗癌剂。

66、64.如实施方案63的方法，其中所述抗癌剂为选自化学治疗剂、抗癌生物制剂、放射线疗法、car-t疗法及溶瘤病毒。

67、65.如实施方案64的方法，其中所述额外治疗剂为抗癌生物制剂。

68、66.如实施方案64或65的方法，其中所述抗癌生物制剂为包含结合肿瘤抗原的结合域的抗体。

69、67.一种将nk细胞介导的细胞毒性反应导向癌细胞的方法，其包含向患有癌症的受试者施用药学上有效量的如实施方案22至35中任一例的多肽、如实施方案36至46中任一例的复合体、如实施方案47至49中任一例的免疫结合物或如实施方案50的药物组合物。

70、68.一种治疗感染性疾病的方法，其包含向患有感染性疾病的受试者施用药学上有效量的如实施方案1至46中任一例的多肽或复合体、如实施方案47至49中任一例的免疫结合物或如实施方案50的药物组合物。

71、69.如实施方案68的方法，其中所述感染性疾病为细菌、病毒或真菌感染。

72、70.如实施方案68或69的方法，其进一步包含施用额外治疗剂。

73、71.如实施方案70的方法，其中所述额外治疗剂为抗生素、抗病毒剂或抗真菌剂。

74、72.一种将自然杀伤介导的细胞毒性反应导向病原体的方法，其包含向患有由所述病原体引起的感染性疾病的受试者施用药学上有效量的如实施方案1至46中任一例的多肽或复合体、如实施方案47至49中任一例的免疫结合物或如实施方案50的药物组合物。

75、73.如实施方案68至72中任一例的方法，其中所述多肽、复合体或免疫结合物包含至少一个结合由所述病原体表达的抗原的结合域。