无包膜病毒的药物组合物的制作方法

本发明涉及药物、基因治疗和医学领域，特别涉及基于重组无包膜病毒，特别是重组腺相关病毒(raav)的载体的药物组合物，所述组合物可用于治疗和预防各种疾病。

背景技术：

1、无包膜病毒的典型代表是细小病毒、诺如病毒以及轮状病毒和腺病毒。

2、简单或无包膜病毒由核酸和称为衣壳的蛋白包膜组成。衣壳由称为衣壳体的重复形态亚基组成。核酸和衣壳彼此相互作用以形成核衣壳。在每种病毒中，衣壳蛋白在衣壳组装期间的低聚通常会导致某种类型的对称四级结构。大多数病毒具有螺旋结构或二十面体结构的衣壳(lidmar j,mirny l,nelson dr.virus shapes and buckling transitionsin spherical shells.phys rev e stat nonlin soft matter phys.2003年11月；68(5pt1):051910.doi:10.1103/physreve.68.051910.epub 2003年11月25日.pmid:14682823)。

3、与无包膜病毒不同，包膜病毒的衣壳被称为超衣壳(supercapsid)的脂质膜覆盖。包膜是衣壳从病毒宿主中的细胞内膜获得的；实例包括内核膜、高尔基体膜和细胞的外膜。脂质包膜的存在使病毒对物理和化学胁迫的抗性降低(alberts b,bray d,lewis j,raffm,roberts k,watson jd(1994).molecular biology of the cell(第4版)第280页)。

4、无包膜病毒的衣壳发挥在长期储存期间保护基因组，以及保护基因组免受化学和物理胁迫(比如uv辐射、极端ph或温度、蛋白水解和核酸裂解剂)的作用。无包膜病毒可以在多孔和非多孔的各种表面上以干燥状态长时间保特其特性(abad fx,pinto rm,boscha.survival of enteric viruses on environmental fomites.appl environmicrobiol.1994年10月；60(10):3704-10.doi:10.1128/aem.60.10.3704-3710.1994.pmid:7986043；pmcid:pmc201876)

5、病毒稳定地将其遗传物质引入宿主细胞的基因组，因此提出将其用作向细胞递送遗传信息的载体。使用基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒等的载体。在这些病毒中，腺病毒和腺病毒是指无包膜病毒。

6、基于重组aav和重组腺病毒的载体是目前应用和开发最广泛的基因治疗产品，并且它们进一步用于疫苗开发中。

7、目前，基因治疗被认为是一种治疗几乎整个疾病谱：传染病、遗传病、恶性肿瘤等的潜在通用方法。

8、病毒或病毒载体(病毒颗粒)必须维持其结构完整性以便具有传染性和生物活性。病毒载体的结构完整性通常在含有病毒载体的疫苗或产品的制备期间被破坏，这排除了其作为递送载体的用途。

9、病毒载体产品是以冷冻形式生产的，需要低于-20℃，通常甚至低于-80℃的储存温度。冻干物解决了这个问题，其最佳储存和运输温度体系为2-8℃。此外，冻干被广泛用于改善含有重组病毒载体的各种病毒疫苗和产品的稳定性。

10、现有技术提供了aav的冻干药物组合物(wo2018/128689、wo2020/014479、wo2020/214929)、腺病毒的冻干药物组合物(wo00/29024、wo2017/013169、wo2018/103601)。

11、然而，冻干物通常相对昂贵，因为它们需要大量的时间和材料成本来生产，并且在冻干物的冻干和重构期间，病毒载体的生物活性可能在一定程度上丧失。此外，最终产品中的残余水(水分)含量显著影响病毒载体在储存期间的稳定性。

12、因此，存在对包含重组无包膜病毒载体的稳定药物组合物的需求，包括允许获得稳定的冻干剂型而不损失病毒载体的生物活性以及具有最小冻干时间的药物组合物。

技术实现思路

1、本发明的作者出乎意料地发现，羟丙基-β-环糊精的添加增加了包含重组无包膜病毒载体的药物组合物在冷冻干燥期间的玻璃化转变温度，这实际上允许减少冷冻干燥过程的持续时间，减少冻干物中的残余水含量，从而导致产生包含重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物，该组合物在储存期间(例如在长期储存期间)具有稳定性。本发明的作者还出乎意料地发现，上述制剂和冻干物生产方法使得可以维持重组无包膜病毒载体的活性长时间不变。此外，本发明的作者出乎意料地发现预冻干溶液(水性药物组合物)是稳定的，并且可用作最终剂型。

2、定义

3、除非本文另有定义，否则结合本发明使用的所有技术和科学术语将具有本领域技术人员通常理解的相同含义。

4、此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数术语，且复数术语应包括单数术语。

5、如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另有规定，否则词语“包括(include)”和“包含(comprise)”或其变体，比如“包括(includes)”、“包括(including)”，“包含(comprises)”或者“包含(comprising)”将理解为意味着包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

6、术语“药物组合物”是指包含治疗有效量的无包膜病毒载体和赋形剂或辅助物质(载体、稀释剂、填料、溶剂等)(其选择和比例取决于施用类型和途径以及剂量)的组合物和/或制剂。

7、如本文使用的术语“水性组合物”是指基于水的组合物，组合物中的水可以是：水、注射用水、生理盐水(0.9％-1.0％氯化钠水溶液)。

8、如本文使用的术语“冷冻干燥”是指已经过本领域已知的冷冻干燥过程的制剂，该过程包括冷冻制剂，然后从冷冻内容物中除去冰。

9、如果活性剂在储存温度(例如2-8℃)下的规定保质期期间保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或者生物活性，则药物组合物是“稳定的”。此外，活性剂可以保持物理和化学稳定性二者以及生物活性。储存期基于加速或自然老化条件下的稳定性测试结果进行调整。

10、如本文使用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。

11、术语“长期储存”或“长期稳定性”应理解为指药物组合物可以储存三个月或更久、六个月或更久、一年或更久，并且该组合物也可以具有至少两年的最低限度稳定保质期。一般来说，术语“长期储存”和“长期稳定性”进一步包括至少与当前可获得的商业制剂通常所需的稳定保质期相当或比其更好，而不会损失稳定性(这将使制剂不适合于其预期的药物应用)的稳定储存持续时间。

12、术语“缓冲剂”是指缓冲剂或缓冲溶液中的酸或碱组分(通常是弱酸或弱碱)。缓冲剂有助于将给定溶液的ph值维持在预先确定值或接近预先确定值，并且通常选择缓冲剂来补足预先确定值。缓冲剂可以是产生所需缓冲作用的单一化合物，特别是当所述缓冲剂与适当量(取决于所需的预先确定值)的其相应“酸/碱缀合物”混合(并且能够适当地与其进行质子交换)时。

13、术语“缓冲剂”或“缓冲溶液”是指包含酸(通常是弱酸，比如乙酸、柠檬酸)和其共轭碱(比如乙酸盐或柠檬酸盐，例如乙酸钠、柠檬酸钠，以及所述盐的水合物，例如乙酸钠三水合物)的混合物，或备选地，碱(通常是弱碱，例如组氨酸)和其共轭酸(例如组氨酸盐酸盐或组氨酸盐酸盐一水合物或l-组氨酸盐酸盐(h/c)一水合物(m/h)或l-组氨酸h/c m/h或组氨酸h/c m/h)的混合物的水溶液。由于“缓冲剂”所赋予的“缓冲作用”，“缓冲溶液”的ph值仅在向其中加入少量强碱或强酸时，以及在稀释或浓缩时轻微变化。

14、通常，氨基酸是l-氨基酸。例如，如果使用组氨酸和组氨酸盐酸盐一水合物，则其通常为l-组氨酸和l-组氨酸盐酸盐一水合物。例如，如果使用精氨酸，则它通常是l-精氨酸。也可以使用氨基酸等价物，例如药学上可接受的脯氨酸盐(例如脯氨酸盐酸盐)。

15、缩写

16、pcr——聚合酶链式反应

17、eia——酶免疫测定

18、fa——功能活性

19、ct——循环次数

20、tu——转导单元

21、t'g——玻璃化转变温度

22、vg——病毒基因组

23、gfp——绿色荧光蛋白基因

24、fam——羧基荧光素染料

25、bhq-1——用于pcr中的荧光猝灭剂(fluorescence extinguisher)

26、moi——感染复数

27、本发明公开了基于重组无包膜病毒，特别是重组腺相关病毒(raav)的载体的稳定药物组合物，该组合物可用于治疗和预防各种疾病。

28、所开发的制剂使得可以生产基于重组无包膜病毒，特别是raav的载体的冻干物，尽管其中高含量的氯化钠是无包膜病毒稳定所必需的。在冻干物中实现了低水含量，这确保了其在长期和加速储存条件二者期间的稳定性。此外，所开发的制剂使得可以通过减少冷冻干燥过程的持续时间来优化冷冻干燥过程。

29、在一个方面，本发明涉及重组无包膜病毒载体的药物组合物，所述组合物包含：

30、(i)重组无包膜病毒载体，

31、(ii)缓冲剂，

32、(iii)羟丙基-β-环糊精,

33、(iv)表面活性剂，

34、(v)氯化钠，

35、(vi)氯化镁，

36、(vii)注射用水。

37、任何药学上可接受的缓冲剂都可用作缓冲剂。缓冲剂是本领域公知的，并且包括但不限于组氨酸、柠檬酸钠、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、甘氨酸、n-甘氨酰甘氨酸、乙酸钠、碳酸钠、赖氨酸、精氨酸、磷酸钠、磷酸钾及其混合物。

38、在本发明的一些实施方案中，缓冲剂是三(羟基甲基)氨基甲烷和盐酸。

39、在本发明的一些实施方案中，三(羟基甲基)氨基甲烷以1.9-8.7mg/ml的浓度存在。

40、在本发明的一些实施方案中，添加盐酸至ph 6.0-8.0。

41、在本发明的一些实施方案中，缓冲剂是l-组氨酸和l-精氨酸。

42、在本发明的一些实施方案中，l-组氨酸以0.4-10.0mg/ml的浓度存在。

43、在本发明的一些实施方案中，l-精氨酸以0.05-10.0mg/ml的浓度存在。

44、在本发明的一些实施方案中，羟丙基-β-环糊精以10.0-200.0mg/ml的浓度存在。

45、任何药学上可接受的表面活性剂都可用作表面活性剂。表面活性剂是本领域公知的，并且包括但不限于聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、各种泊洛沙姆和普朗尼克以及其混合物。

46、在本发明的一些实施方案中，表面活性剂以0.01-2.0mg/ml的浓度存在。

47、在本发明的一些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆188。

48、在本发明的一些实施方案中，氯化钠以1.0-15.0mg/ml的浓度存在。

49、在本发明的一些实施方案中，氯化镁以0.05-1.0mg/ml的浓度存在。

50、氯化镁既可以以无水氯化镁的形式使用，也可以以其水合物的形式使用。在本发明的一些实施方案中，氯化镁是氯化镁六水合物。

51、在本发明的一些实施方案中，药物组合物进一步包含二糖。

52、任何药学上可接受的二糖都可用作二糖。二糖在本领域中是公知的，并且包括但不限于海藻糖、蔗糖以及其混合物。

53、在本发明的一些实施方案中，二糖以10.0-200.0mg/ml的浓度存在。

54、在本发明的一些实施方案中，二糖是海藻糖。

55、海藻糖既可以以无水海藻糖的形式使用，也可以以其水合物的形式使用。在本发明的一些实施方案中，海藻糖是海藻糖二水合物。

56、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

57、

58、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

59、

60、

61、在本发明的一些实施方案中，三(羟基甲基)氨基甲烷以2.22-7.76mg/ml或2.22-7.46mg/ml或2.42-7.26mg/ml或1.9-3.0mg/ml或2.22-2.66mg/ml或2.42mg/ml或5.7-8.7mg/ml或6.76-7.76mg/ml或7.06-7.46mg/ml或7.26mg/ml的浓度存在。

62、在本发明的一些实施方案中，添加盐酸至ph 7.0-8.0或至ph7.3-7.8或至ph 7.4-7.6或至ph 7.5。

63、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

64、

65、在本发明的一些实施方案中，l-组氨酸以2.0-9.24mg/ml或2.58-8.74mg/ml或2.79-8.37mg/ml或2.0-3.58mg/ml或2.29-3.08mg/ml或2.58-3.0mg/ml或2.79mg/ml或6.0-10.0mg/ml或7.5-9.24mg/ml或8.0-8.74mg/ml或8.37mg/ml的浓度存在。

66、在本发明的一些实施方案中，l-精氨酸以0.248-1.344mg/ml或0.3-1.2mg/ml或0.348-1.044mg/ml或0.248-0.448mg/ml或0.3-0.396mg/ml或0.348mg/ml或0.744-1.344mg/ml或0.888-1.2mg/ml或1.044mg/ml的浓度存在。

67、在本发明的一些实施方案中，羟丙基-β-环糊精以30.0-110mg/ml或40.0-105.0mg/ml或50.0-100.0mg/ml、30.0-70.0mg/ml或40.0-60.0mg/ml或45.0-55.0mg/ml或50.0mg/ml或90.0-200.0mg/ml或90.0-110.0mg/ml或95.0-105.0mg/ml或100.0mg/ml的浓度存在。

68、在本发明的一些实施方案中，表面活性剂以0.035-1.8mg/ml或0.05-1.5mg/ml或0.01-0.1mg/ml或0.035-0.065mg/ml或0.05mg/ml或0.1-1.0mg/ml或0.35-0.65mg/ml或0.5mg/ml或1.0-2.0mg/ml或1.2-1.8mg/ml或1.5mg/ml的浓度存在。

69、在本发明的一些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆188。

70、在本发明的一些实施方案中，氯化钠以2.5-14.14mg/ml或3.88-13.64mg/ml或3.0-13.14mg/ml或4.38-6.5mg/ml或4.5-6.0mg/ml或1.0-7.0mg/ml或1.0-6.0mg/ml或2.5-3.5mg/ml或3.0mg/ml或3.88-4.88mg/ml或4.38mg/ml或4.5mg/ml或5.5-6.5mg/ml或6.0mg/ml或9.0-15.0mg/ml或12.14-14.14mg/ml或12.64-13.64mg/ml或13.14mg/ml的浓度存在。

71、在本发明的一些实施方案中，氯化镁以0.15-0.7mg/ml或0.173-0.659mg/ml或0.203-0.609mg/ml或0.15-0.50mg/ml或0.173-0.233mg/ml或0.203mg/ml或0.5-0.7mg/ml或0.559-0.659mg/ml或0.609mg/ml的浓度存在。

72、在本发明的一些实施方案中，氯化镁是氯化镁六水合物。

73、在本发明的一些实施方案中，上述药物组合物进一步包含浓度为10-200mg/ml或20.0-150.0mg/ml或25.0-100.0mg/ml或25.0-50.0mg/ml或20.0-30.0mg/ml或23.0-27.0mg/ml或25.0mg/ml或30.0-70.0mg/ml或30.0-36.6mg/ml或32.3-34.3mg/ml或33.3mg/ml或或45.0-55.0mg/ml或50.0mg/ml或90.0-200.0mg/ml或100.0mg/ml的二糖。

74、在本发明的一些实施方案中，二糖是海藻糖。

75、在本发明的一些实施方案中，海藻糖是海藻糖二水合物。

76、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

77、

78、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

79、

80、

81、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

82、

83、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

84、

85、

86、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

87、

88、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

89、

90、

91、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

92、

93、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

94、

95、

96、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

97、

98、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

99、

100、

101、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

102、

103、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

104、

105、

106、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

107、

108、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

109、

110、

111、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

112、

113、在本发明的一些实施方案中，海藻糖是海藻糖二水合物。

114、在本发明的一些实施方案中，氯化镁是氯化镁六水合物。

115、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

116、

117、

118、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

119、

120、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

121、

122、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

123、

124、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

125、

126、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

127、

128、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

129、

130、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

131、

132、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

133、

134、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

135、

136、

137、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

138、

139、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

140、

141、

142、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

143、

144、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

145、

146、在本发明的一些实施方案中，药物组合物包含：

147、

148、在本发明的一些实施方案中，添加盐酸至ph 7.0-8.0或至ph7.3-7.8或至ph 7.4-7.6或至ph 7.5。

149、在本发明的一些实施方案中，上述药物组合物适合于冻干，即它们可以用作预冻干溶液。

150、在一个方面，本发明涉及重组无包膜病毒载体的药物组合物，该组合物以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，在施用前溶解在合适的溶剂(例如水)中。这种药物组合物可以通过例如冻干(即本领域已知的冷冻干燥方法，其涉及冷冻产品，然后从冷冻内容物中除去溶剂)制备。

151、在一个方面，本发明涉及重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物，所述组合物通过冻干上述任何药物组合物来产生。因此，根据本发明的药物组合物可以是水性药物组合物或冻干药物组合物(冻干物)。

152、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物是通过冻干药物组合物来产生的，所述药物组合物包含：

153、

154、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物是通过冻干药物组合物来产生的，所述药物组合物包含：

155、(i)重组无包膜病毒载体，

156、

157、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物是通过冻干药物组合物来产生的，所述药物组合物包含：

158、

159、

160、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物是通过冻干药物组合物来产生的，所述药物组合物包含：

161、

162、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物是通过冻干药物组合物来产生的，所述药物组合物包含：

163、

164、

165、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物是通过冻干药物组合物来产生的，所述药物组合物包含：

166、

167、冻干物用于生产其他剂型。例如，用于制备可注射溶液的冻干物、用于制备输注溶液的冻干燥物、用于制备浓缩物的冻干物，所述浓缩物用于制备输注溶液。通过将冻干物溶解在合适的溶剂中，最典型地溶解在注射用水中，来重构冻干物。此外，冻干组合物首先在所需体积的溶剂(最典型地在水中)中重构，并然后在合适的溶剂(例如5％葡萄糖溶液、0.9％氯化钠溶液)中进一步稀释。

168、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物旨在用于制备可注射溶液。

169、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物旨在用于制备用于肌内、静脉内或皮下施用的溶液。

170、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物存在于小瓶中。

171、在本发明的一些实施方案中，小瓶是玻璃或塑料小瓶。

172、在一个方面，本发明涉及重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物，所述组合物在水性溶剂中重构后包含：

173、(i)重组无包膜病毒载体，

174、(ii)缓冲剂，

175、(iii)羟丙基-β-环糊精，

176、(iv)表面活性剂，

177、(v)氯化钠，

178、(vi)氯化镁，

179、(vii)注射用水。

180、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

181、

182、

183、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

184、

185、在本发明的一些实施方案中，三(羟基甲基)氨基甲烷以2.22-2.66mg/ml的浓度存在，或以2.42mg/ml的浓度存在。

186、在本发明的一些实施方案中，添加盐酸至ph 7.0-8.0或至ph7.3-7.8或至ph 7.4-7.6、ph 7.5。

187、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

188、

189、在本发明的一些实施方案中，l-组氨酸以2.0-3.58mg/ml或2.29-3.08mg/ml或2.58-3.0mg/ml或2.79mg/ml的浓度存在。

190、在本发明的一些实施方案中，l-精氨酸以0.248-0.448mg/ml或0.3-0.396mg/ml或0.348mg/ml的浓度存在。

191、在本发明的一些实施方案中，羟丙基-β-环糊精以30.0-70.0mg/ml或30.0-36.6mg/ml或33.3mg/ml或40.0-60.0mg/ml或45.0-55.0mg/ml或50.0mg/ml或90.0-100.0mg/ml、100.0mg/ml的浓度存在。

192、在本发明的一些实施方案中，表面活性剂以0.01-0.1mg/ml或0.035-0.065mg/ml或0.05mg/ml或0.1-1.0mg/ml或0.35-0.065mg/ml或0.5mg/ml的浓度存在。

193、在本发明的一些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆188。

194、在本发明的一些实施方案中，氯化钠以1.0-7.0mg/ml或1.0-6.0mg/ml或2.5-3.5mg/ml或3.0mg/ml或3.88-4.88mg/ml或4.38mg/ml或4.5mg/ml或5.5-6.5mg/ml或6.0mg/ml的浓度存在。

195、在本发明的一些实施方案中，氯化镁以0.15-0.50mg/ml或0.173-0.233mg/ml或0.203mg/ml的浓度存在。

196、在本发明的一些实施方案中，氯化镁是氯化镁六水合物。

197、在本发明的一些实施方案中，上述药物组合物进一步包含浓度为20.0-100.0mg/ml、20.0-30.0mg/ml或23.0-27.0mg/ml或25.0mg/ml或30.0-70.0mg/ml或30.0-36.6mg/ml或32.3-34.3mg/ml或33.3mg/ml或45.0-55.0mg/ml或50.0mg/ml的二糖。

198、在本发明的一些实施方案中，二糖是海藻糖。

199、在本发明的一些实施方案中，海藻糖是海藻糖二水合物。

200、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

201、

202、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

203、

204、

205、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

206、

207、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

208、

209、

210、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

211、

212、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

213、

214、

215、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

216、

217、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

218、

219、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

220、

221、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

222、

223、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

224、

225、

226、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体的冻干药物组合物在水性溶剂中重构之后包含：

227、

228、所描述的药物组合物适合于将治疗剂递送给受试者以治疗或预防各种疾病或病症。它们可用于基因治疗中，所述基因治疗用于治疗比如血友病a、血友病b、恶性肿瘤、脊髓性肌萎缩等疾病，以及用于开发用于预防例如传染病的疫苗中。

229、根据本发明的药物组合物可包含各种浓度的重组无包膜病毒载体。病毒载体的浓度可以取决于例如待使用上述药物组合物预防或治疗的疾病，以及患者的年龄、体重和健康状态，并且因此可以因患者而异。合适的剂量可以通过主治医师的决定进行调整，从而可以将其一次或通过若干次注射施用给患者。

230、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体以1.0*105-1.0*1014个病毒基因组/ml或1.0*109-1.0*1014个病毒基因组/ml或1.0*109-5.0*1013个病毒基因组/ml或1.0*109-1.0*1013个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*105个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*106个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*107个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*108个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*109个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*1010个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*1011个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*1012个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*1013个病毒基因组/ml或(1.0±0.5)*1014个病毒基因组/ml的浓度存在。

231、上述药物组合物中的重组无包膜病毒可以是raav、重组腺病毒和其他类型的重组无包膜病毒。

232、重组腺病毒载体可以使用腺病毒或嵌合腺病毒的任何物种、株系、血清型或腺病毒或嵌合腺病毒的物种、株系或血清型的任何组合来生产。人腺病毒血清型包括血清型2、4、5、7、11、26、34、35、36、48、49或50中的任一种或其组合、衍生物、修饰或假型。

233、在本发明的一些实施方案中，重组无包膜病毒载体是raav载体。它可以使用任何株系、aav血清型(例如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15和aav16)或株系、血清型的任何组合(例如包括两种或更多种血清型的raav载体)来生产；可以含有任何血清型(aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15和aav16)的aav衣壳蛋白(衣壳)或其组合、衍生物、修饰或假型。

234、在本发明的一些实施方案中，raav载体包含aav5或aav9衣壳。

235、在本发明的一些实施方案中，aav5或aav9衣壳可以是修饰的衣壳。

236、raav载体可以进行遗传修饰和/或化学修饰。

237、raav载体可以进行遗传修饰，以产生具有改变的受体用途、抗原性、转导效率和/或组织嗜性的raav载体，并将肽配体、抗体、抗体片段、mhc(主要组织相容性复合体)和/或受体插入病毒衣壳中。例如，raav载体可以通过引入一个或多个氨基酸突变(比如点突变)进行遗传修饰。

238、短语“多个点突变”是指两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个点取代。

239、特别优选的实施方案包括性质上保守的取代(突变)，即在根据侧链分类的氨基酸家族内发生的取代。特别地，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，以及(4)不带电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类为芳香族氨基酸。例如，可以合理预测的是，亮氨酸单独取代为异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸单独取代为谷氨酸、苏氨酸单独取代为丝氨酸或氨基酸类似地保守取代为结构上相关的氨基酸将不会对生物活性具有重大影响。例如，目的多肽可以包括多达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，只要分子的所需功能保持完整即可。

240、使用氨基酸取代的aav蛋白vp1、vp2或vp3序列中的点突变的变体是用另一个氨基酸残基取代aav蛋白vp1、vp2或vp3中的至少一个氨基酸残基。

241、保守取代显示于表a中的“优选取代”下。

242、

243、

244、例如，国际申请wo2012/145601描述了具有变体衣壳蛋白的腺相关病毒(aav)病毒粒子，其中与野生型aav相比，当经由玻璃体内注射施用时，aav病毒粒子对视网膜细胞表现出更大的感染性。国际申请wo2013/158879描述了一种腺相关病毒(aav)载体，其用于向受试者递送包含vp1衣壳蛋白的异源核酸序列，所述vp1衣壳蛋白包含一个或多个赖氨酸取代，其中一个赖氨酸取代是k137r，其中所述赖氨酸取代对抑制所述衣壳蛋白的泛素化有效，从而提高所述avv载体在靶细胞中的转导效率。

245、raav载体可以进行化学修饰以改变组织嗜性。此外，基于化学修饰的raav的载体可表现出改变的受体用途、抗原性、转导效率和/或组织嗜性。化学修饰的raav载体是通过使用例如化学选择性反应产生的，所述化学选择性反应可靶向氨基酸的特定侧链，可用于改变aav衣壳上的受体结合结构域内的电荷、极性、疏水性和氢键的电势。

246、在本发明的一些实施方案中，所述根据本发明的重组无包膜病毒载体的药物组合物旨在用于肠胃外施用。

247、在本发明的一些实施方案中，所述根据本发明的重组无包膜病毒载体的药物组合物旨在用于肌内、静脉内或皮下施用。

248、在本发明的一些实施方案中，所述根据本发明的重组无包膜病毒载体的药物组合物可以作为输注物静脉内施用。

249、根据本发明的重组无包膜病毒载体的药物组合物可以在稀释后使用。为此，将所需体积的组合物从小瓶转移到包含无菌0.9％氯化钠溶液或无菌5％葡萄糖溶液的输注容器中。通过轻轻地翻转输注容器来搅拌所得溶液。

250、在本发明的一些实施方案中，治疗的受试者或患者是哺乳动物，优选人受试者。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。

251、根据本发明的药物组合物可以储存在任何合适的容器中。例如，所需体积的玻璃或塑料容器、小瓶、安瓿、注射器、药筒或瓶。容器可具备额外的用于施用的手段，比如滴管、自动注射器。

252、根据本发明的药物组合物可以以单一单位剂量或多个单一单位剂量的形式，以现成制剂形式制造、包装或广泛销售。如本文使用的术语“单一单位剂量”是指含有预先确定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于待在受试者中施用的活性成分的剂量，或这种剂量的方便部分，例如这种剂量的一半或三分之一。

253、根据需要，药物组合物可以作为单一治疗剂施用，或者与另外的治疗剂组合施用。因此，在一个实施方案中，本发明的用于治疗和/或预防的方法与治疗有效量的另一种活性剂的施用组合使用。其他活性剂可以在施用根据本发明的药物组合物之前、期间或之后施用。另一种活性剂可以作为本发明组合物的部分施用，备选地，作为单独的制剂施用。

254、实施例

255、提供以下实施例是为了更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明的目的，且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

256、本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文。尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式详细描述了前述发明，但是根据本发明的教导，本领域的普通技术人员将显而易见的是，在不背离所附实施方案的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。

257、方法

258、1.通过差示扫描量热法确定热转变。

259、在美国perkin-eimer的dsc4000差示扫描量热计上，通过差示扫描量热法在带橡胶环的加盖钢坩埚中确定热转变。该测试使用了50μl的样品。使用赋形剂溶液或工艺溶液作为测试溶液。研究了在从(25)℃到(-85)℃范围内(增量在0.5-10℃/min范围内)的温度转变。使用pyris series dsc4000软件确定相变温度。

260、2.水含量的确定。

261、根据rf sp gm.1.2.3.0002.15，通过k.fischer法测量水含量。

262、3.通过pcr测定aav产物中病毒基因组(gfp基因)的浓度。

263、使用正向、反向引物和与fam染料以及bhq1猝灭剂缀合的探针，通过定量聚合酶链式反应确定aav产物中gfp基因的浓度。引物与编码gfp蛋白的基因的区域匹配。在样品制备期间，首先用dna酶处理样品以去除残留的质粒dna，然后用蛋白酶处理样品以破坏衣壳。使用线性化的质粒(paav gfpcellbiolab)绘制校准线。为了绘制作为循环次数(ct)的函数的对数浓度的校准线，使用了增量为10的标准品。通过作为ct的函数的对数浓度的校准线来确定产物中病毒基因组/ml(vg/ml)或拷贝/ml的浓度。

264、4.通过酶免疫测定来确定病毒颗粒的浓度。

265、病毒载体颗粒(腺相关病毒(aav)衣壳)的浓度通过使用商业试剂盒的以下酶免疫测定来测量：progen aav5滴定elisa和progen aav9滴定elisa。

266、用识别特定血清型的构象表位的抗aav衣壳结合单克隆小鼠抗体来涂覆高结合96孔板。aav衣壳蛋白在温度孵育下与抗体结合，通过多次洗涤板来除去样品的未结合组分。

267、使用在板的温度孵育下与aav衣壳蛋白结合的生物素化抗体作为检测抗体。通过多次洗涤板来除去未结合的组分。

268、应用链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物来检测颜色。链霉亲和素与生物素结合，通过多次洗涤板来除去未结合的组分。

269、四甲基联苯胺起发色团的作用。辣根过氧化物酶、过氧化氢和四甲基联苯胺发色团的相互作用产生显色反应。通过加入终止溶液(1正常h2so4)来终止eia反应，并在450nm的波长下测量孔中溶液的光密度。通过使用具有已知aav颗粒浓度的标准溶液的光密度数据绘制的校准曲线图来确定产物中病毒载体颗粒的浓度。

270、5.基于包含gfp基因的重组腺相关病毒载体确定产物的功能活性。

271、通过产物诱导的cho-k1细胞中的gfp表达来测量基于包含gfp基因的重组腺相关病毒载体的产物的转导活性。

272、为了转导，在分析当天，将cho-k1细胞以1×104个细胞/cm2(19,000个细胞/孔)的比率接种到24孔板中的含有抗生素的生长培养基(用于定量测定的mqd-培养基)中，并在+37℃的温度下在5％ co2的气氛中孵育4-8h，以使细胞附着到塑料表面。然后将3个剂量的测试样品(每个3个重复)引入到具有细胞的孔中。预先选择每种aav血清型的产物剂量(moi)，以便在转导后分别获得约5％、10％和20％的gfp阳性细胞。使用以下公式计算转导孔所需的产物体积：

273、

274、其中v是每孔所需的产物体积(ml)，s是一个孔的面积(cm2)，moi是所需产物剂量，感染复数(vg/cl)，k是孔中的细胞接种密度(个细胞/cm2)，c是产物中含基因组衣壳的浓度(vg/ml)。

275、将含有转导细胞的板在co2培养箱(5％ co2,+37℃)中孵育2-3天。孵育期之后，从孔中收集培养液，用hanks溶液洗涤细胞，并使用tryple溶液(150μl/孔)将细胞从塑料移除。将细胞从塑料分离后，将hanks溶液(与tryple为1:1)引入到孔中，将细胞收集到1.5ml微管中，并在300g下离心5min。将细胞沉淀重悬于150μl的hanks溶液中。除了1个同种型对照孔外，向每个样品中加入50ml用于确定hanks溶液中活细胞的工作染料溶液，将细胞在室温下在黑暗中孵育20分钟。将染色的细胞在300g下离心5分钟，小心地选择上清液，并向每个样品中加入100μl的bd cytofix固定缓冲液。将细胞重悬，并将所得细胞悬浮液的全部体积转移到用于流式细胞仪的96孔v形底板中，将具有细胞的板在室温下在黑暗中孵育20分钟。孵育期之后，将板在1200rpm下离心5分钟，收集固定缓冲液，并以100μl/孔用染色缓冲液(含有0.1％叠氮化钠和0.5％ bsa的pbs)洗涤细胞。将板再次离心，并收集缓冲液，然后以150μl/孔引入染色缓冲液，并小心地重悬细胞。

276、在流式细胞仪上对细胞进行分析。评估细胞活力和gfp表达。根据以下公式计算每个产物剂量的fa(功能活性)或tu(转导单位)/ml的值：

277、

278、其中p是以百分比表示的gfp阳性活细胞的数量，n是初始接种的细胞的数量(n＝s×k)，v是每孔引入的产物体积(ml)，d是产物预稀释因子。

279、3个产物剂量的平均tu值被认为是最终结果。

280、6.制剂的制备。

281、在压力下在stirred cell(millipore)浓缩池中制备具有目标含量的病毒基因组的样品。为此，将含有病毒颗粒的初始溶液制剂置于渗滤容器中，然后将至少10倍体积的具有目标制剂的水溶液引入到池中，所述目标制剂包括缓冲剂、渗压剂和额外的水溶性稳定剂(如果需要的话)。渗滤过程之后，将溶液浓缩至超过目标密度的光密度，从仪器中取出，通过紫外分光光度法确定确切的光密度并通过pcr确定病毒基因组的浓度。然后将适当的赋形剂溶液加入样品中以制备具有目标病毒基因组含量的溶液。

282、此外，在pellicon(millipore)盒中以切向流动模式获得含有病毒颗粒的溶液样品。为此，将初始溶液制剂置于渗滤槽中，然后将至少10倍体积的具有目标制剂的溶液提供给系统，所述目标制剂包含缓冲剂、渗压剂和额外的水溶性稳定剂(如果需要的话)。备选地，可以在渗滤后加入渗压剂和水溶性稳定剂的浓缩物。渗滤过程之后，将溶液浓缩至超过目标密度的光密度，从系统中取出，并确定光密度的确切值和病毒基因组的浓度。然后将适当的赋形剂溶液加入样品中以制备具有目标病毒基因组含量的溶液。

283、当制备包含增溶剂的制剂时，在渗滤和浓缩后将表面活性剂浓缩物加入溶液中，用赋形剂溶液最终稀释至目标病毒基因组含量。

284、在无菌填充到最终容器(例如玻璃/塑料容器、小瓶或注射器)中之前，使用0.22μm膜过滤溶液。

285、实施例1.制剂的冻干。

286、我们根据以下方案对制剂进行冷冻干燥：冷冻持续时间长达300分钟，温度最高-70℃。初始干燥持续时间长达4000分钟，温度从-40°с到40°с。真空度从0毫巴到0.25毫巴。二次干燥持续时间长达4000分钟，温度从0°с到40°с。真空度从0毫巴到0.25毫巴。每个步骤都包括一个或多个阶段。

287、实施例2.选择制剂以优化冷冻干燥模式。

288、优化的目的是减少冷冻干燥过程的持续时间，以及减少冻干物中的残余水含量。为了这个目的，建议批准若干制剂，然后测量玻璃化转变温度。

289、已知的是，向制剂中加入氯化钠有助于降低制剂的玻璃化转变温度(electrolyte-induced changes in glass transition temperature of freeze-concentrated solutes,pharmaceutical research,第12卷,no.5,1995)。然而，该组分是病毒颗粒的有效稳定剂，防止其聚集，并且不能从制剂中排除(pharmaceuticaldevelopment of aav-based gene therapy products for the eye.gerard a.rodrigues和evgenyi shalaev和thomas k.karami和james cunningham和nigel k.h.slater和hongwen m.rivers,pharm res(2019)36:29)。

290、当将冻干机架的温度设置并维持在系统和产品稳定性的上限时，冷冻干燥过程是最有效的。因此，温度应设置在比塌陷温度低几度的水平上。塌陷意指冷冻干燥期间产生的结构在通过升华相分离边界时被破坏的过程。这不仅可导致冻干物的功能特性改变，而且由于蒸发途径受阻而导致冷冻干燥效率降低，造成水分保留和分布不均。

291、在最终赋形剂溶液中的所得物质为无定形混合物。玻璃化转变温度为不可结晶的物质或没有时间结晶的物质变为固体，进入玻璃态的温度。溶液的塌陷温度通常比玻璃化转变温度高1-3℃。因此，玻璃化转变温度越高，可为架设置的温度就越高，导致冷冻干燥过程加速。

292、选择以下赋形剂进行筛选：三(羟基甲基)氨基甲烷(缓冲剂、维持所需ph水平)、氯化钠(稳定剂、渗压剂(osmolytic))、氯化镁六水合物(稳定剂)、海藻糖二水合物(稳定剂、渗压剂、冻干保护剂(lyoprotector)))、泊洛沙姆p188(增溶剂)、聚乙烯吡咯烷酮k-30(稳定剂)、聚乙烯吡咯烷酮k-90(稳定剂)、磺丁基醚-β-环糊精钠盐(稳定剂、冻干保护剂)、羟丙基-β-环糊精(稳定剂、冻干保护剂)、l-组氨酸(缓冲剂、维持所需ph水平、稳定剂)、l-精氨酸(缓冲剂、维持所需ph水平、稳定剂)。

293、确定测试赋形剂溶液的玻璃化转变温度的结果显示于表2中。

294、表2——不同制剂的玻璃化转变温度。

295、

296、

297、

298、根据结果，发现羟丙基-β-环糊精显著提高了包含氯化钠的混合物的玻璃化转变温度。

299、进一步的开发目的是确定海藻糖二水合物、羟丙基-β-环糊精和氯化钠的最佳含量比例，以及评估l-组氨酸和l-精氨酸缓冲溶液产生亲液形式的适用性。在具有两个水平和中心点重复3次的完整三因子混合设计实验中，对含有约1×10-11vg/ml包含gfp基因的重组aav5的样品进行研究。研究了海藻糖二水合物(0.0至100.0mg/ml)、氯化钠(3.0至12.0mg/ml)的浓度和羟丙基-β-环糊精的浓度(0.0至100.0mg/ml)作为定量因子。泊洛沙姆188(在0.05-2.0mg/ml的范围内)和氯化镁六水合物(在0.15-0.70mg/ml的范围内)对玻璃化转变温度没有统计学显著影响。

300、实验结果显示于表3中。

301、表3——浓度为1×1011vg/ml的基于aav5的制剂的实验结果

302、

303、

304、所得数据在modde软件中进行处理。

305、根据结果，14号制剂(l-组氨酸——2.79mg/ml；l-精氨酸——0.348mg/ml；氯化镁六水合物——0.203mg/ml；泊洛沙姆p188——0.5mg/ml；氯化钠——3.0mg/ml；羟丙基-β-环糊精——100.0mg/ml)显示出最大玻璃化转变温度。

306、此外，评估了冷冻干燥过程对包含gfp基因的重组aav5和重组aav9病毒颗粒的影响，确定了病毒颗粒浓度的工作范围，以及对l-精氨酸、l-组氨酸和三(羟基甲基)氨基甲烷缓冲溶液产生亲液形式的适用性进行了比较评估。示出表4中列出的组合物的数据。

307、表4——冷冻干燥制剂的列表

308、

309、

310、aav5和aav9冻干物的质量控制结果显示于表5、表6中。

311、表5——aav5冻干物的质量控制结果

312、

313、表6——aav9冻干物的质量控制结果

314、

315、已经显示所有测试制剂都适合生产冻干剂型。所有测试样品中的水含量不超过1.4％，冻干重构时间不超过10秒，并且冷冻干燥时间仅为48小时。重构后，未观察到样品的滴度和功能活性的降低。

316、然后生产具有不同病毒基因组含量的制剂。具有不同病毒基因组含量的aav5和aav9冻干物的质量控制结果显示于表7中。所示为25号制剂的数据。

317、表7——具有不同病毒基因组含量的aav5和aav9冻干物的质量控制结果

318、

319、为了进一步评估冻干3倍浓缩溶液的可能性，制备了aav5和aav9的预冻干组合物，如表8和表9中所示。冻干物重构后所得样品的控制结果显示于表10中。

320、表8——浓缩的基于三(羟基甲基)氨基甲烷的aav5(27号)和aav9(28号)制剂

321、 组分 预冻干溶液 3倍浓缩预冻干溶液 重构溶液 aav5或aav9 <![cdata[1×10¹¹vg/ml]]> <![cdata[3×10¹¹vg/ml]]> <![cdata[1×10¹¹vg/ml]]> 氯化钠 4.38mg/ml 13.14mg/ml 4.38mg/ml 氯化镁六水合物 0.203mg/ml 0.609mg/ml 0.203mg/ml 海藻糖二水合物 33.3mg/ml 100.0mg/ml 33.3mg/ml 羟丙基-β-环糊精 33.3mg/ml 100.0mg/ml 33.3mg/ml 泊洛沙姆p188 0.5mg/ml 1.5mg/ml 0.5mg/ml 三(羟基甲基)氨基甲烷 2.42mg/ml 7.26mg/ml 2.42mg/ml 盐酸 至ph 7.5 至ph 7.5 至ph 7.5

322、表9——浓缩的基于l-组氨酸和l-精氨酸的aav5(29号)和aav9(30号)制剂

323、 组分 预冻干溶液 3倍浓缩预冻干溶液 重构溶液 aav5或aav9 <![cdata[1×10¹¹vg/ml]]> <![cdata[3×10¹¹vg/ml]]> <![cdata[1×10¹¹vg/ml]]> 氯化钠 4.38mg/ml 13.14mg/ml 4.38mg/ml 氯化镁六水合物 0.203mg/ml 0.609mg/ml 0.203mg/ml 海藻糖二水合物 33.3mg/ml 100.0mg/ml 33.3mg/ml 羟丙基-β-环糊精 33.3mg/ml 100.0mg/ml 33.3mg/ml 泊洛沙姆p188 0.5mg/ml 1.5mg/ml 0.5mg/ml l-组氨酸 2.79mg/ml 8.37mg/ml 2.79mg/ml l-精氨酸 0.348mg/ml 1.044mg/ml 0.348mg/ml

324、表10——从浓缩预冻干aav5和aav9溶液获得的重构冻干物的控制结果(在3倍溶剂体积中重构)

325、

326、此外，制备病毒基因组(拷贝)浓度约为1×1011/ml(以预冻干制剂表示)的制剂，并转移到稳定性研究中。

327、25号制剂的稳定性研究结果显示于表11、12中。

328、表11——aav5冻干物稳定性研究结果(25号制剂)

329、

330、表12——aav9冻干物稳定性研究结果(25号制剂)

331、

332、

333、因此，我们开发了稳定的冻干制剂，其表现出更短的冷冻干燥过程时间和低残余水含量。所开发的组合物可应用于腺相关病毒和其他类型的无包膜病毒。