阳离子交换剂上的腺相关病毒分离的制作方法

背景技术：

1、腺相关病毒(aav)是一种小型、无包膜病毒，其包装了线性单链dna基因组。aav属于细小病毒科(parvoviridae)和依赖病毒属(dependovirus)，因为aav的生产性感染仅在辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)存在的情况下发生。即使在辅助病毒不存在的情况下，aav病毒(血清型2)也可以通过整合入宿主人基因组的19q13.4号染色体来实现潜伏。所述aav病毒是已知的唯一能够位点特异性整合的哺乳动物dna病毒(daya和berns,clinicalmicrobiology reviews,第583-593页(2008))。

2、为了让aav在临床上安全使用，已将aav在其基因组的几个位置进行了遗传修饰。例如，在许多病毒载体中，rep基因(其是病毒复制所需的)和位点特异性整合所需的元件已经从aav基因组中消除。这些重组aav(raav)以染色体外状态存在，并且整合到基因组dna中的效率非常低。因此，raav在宿主细胞中诱导随机诱变的可能性即使没有完全消除也有所降低。由于这些特性和缺乏致病性，raav作为基因疗法载体在临床前和临床应用的多个方面显示出巨大的前景。新的血清型和自身互补载体正处于临床测试中。除了这些正在进行的载体开发以外，持续的努力还集中在可扩展的制造工艺上，所述工艺可以高效地产生高滴度的具有高纯度和高效力的raav载体。

3、尽管已作出很大努力以设计高效、大规模的方法来纯化适合人施用的aav产物，但仍需要更好的aav纯化方法。例如，目前在细胞培养物中生成aav的方法会导致“空”衣壳形成，这已被证明会导致t细胞介导的针对衣壳抗原的免疫应答，从而导致低度肝毒性和部分丧失表达式(wright,molec therapy 22(1):1-2(2014))。因此，需要包括从最终aav产物中除去空aav衣壳的步骤的aav纯化方法。

技术实现思路

1、细胞培养中aav载体生成的特征是形成过量的“空”衣壳，其缺乏载体基因组。此类空衣壳无法提供与转基因产生相关的治疗益处。空衣壳对临床结果的影响尚不清楚。然而，有可能增加对载体的先天或适应性免疫应答，从而使空衣壳成为基因治疗背景下的一个问题。wright,molec therapy 22(1):1–2(2014)。

2、本文提供了从包含完整aav衣壳和空aav衣壳的aav配制物中纯化完整aav衣壳以提供基本上不含空aav衣壳的aav产物的方法，其包括以下步骤：

3、(a)提供包含空aav衣壳、完整aav衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

4、(b)在所述完整aav衣壳和所述空aav衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

5、(c)在从空aav衣壳中纯化出完整aav衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至阳离子交换柱。

6、本文提供了分离aav配制物中的完整aav衣壳和空aav衣壳的方法，其包括以下步骤：

7、(a)提供包含空aav衣壳、完整aav衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

8、(b)在所述完整aav衣壳和所述空aav衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

9、(c)在从所述空aav衣壳中分离出所述完整aav衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

10、本文提供了分离aav配制物中的空aav衣壳和完整aav衣壳的方法，其包括以下步骤：

11、(a)提供包含空aav衣壳、完整aav衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

12、(b)在所述空aav衣壳和所述完整aav衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

13、(c)在从所述完整aav衣壳中纯化出所述空aav衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

14、本文提供了分离aav配制物中的空aav衣壳和完整aav衣壳的方法，其包括以下步骤：

15、(a)提供包含空aav衣壳、完整aav衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

16、(b)在所述空aav衣壳和所述完整aav衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

17、(c)在从所述完整aav衣壳中分离出所述空aav衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱

18、在一些方面，所公开的方法还可用于纯化adv颗粒、慢病毒颗粒、γ逆转录病毒载体颗粒、单纯疱疹病毒(hsv)颗粒、猿猴病毒40(sv40)颗粒、甲病毒颗粒、披膜病毒科颗粒、罗斯河病毒颗粒和痘苗病毒颗粒。在一些方面，所公开的方法还可用于生产载体疫苗。

19、在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子选自由na+、k+、nh4+、li+、cs+及其组合组成的组。在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是na+。

20、在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约5mm至约1500mm。在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约30mm。

21、在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子选自由ca2+、mg2+、zn2+、mn2+、cu2+、fe2+、ba2+、sr2+、co2+及其组合组成的组。在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是ca2+。

22、在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约1mm至约30mm。在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约至约2mm。

23、在一些实施方案中，第一溶液具有约5.0至约8.5的ph。在一些实施方案中，第一溶液具有约6.0的ph。

24、在一些实施方案中，第一溶液还包含一种或多种表面活性剂。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂选自由以下各项组成的组：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚氧乙烯二醇叔辛基苯酚醚、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)-脱水山梨醇-单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80))、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、克列莫佛、还原triton n-101、triton x-100及其组合。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。

25、在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂的总量为约0.0025w/w％至约0.0075w/w％。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂的总量为约0.005w/w％。

26、在一些实施方案中，阳离子交换柱包含具有带电基团的树脂，其中带电基团是磺酸根、硫酸根、磺丙基、羧基、磷酸根或其组合。在一些实施方案中，阳离子交换柱包含树脂，其中所述树脂是capto s、eshmuno s、mustang s、poros 50hs、poros 50xs、s-sepharoseff、source s、capto mmc、toyopearl gigacap s、gigacap cm、toyopearl sp、toyopearlcm、macroprep s、unospheres、macroprepcm、fractogel emd so3、fractogel emd coo、fractogel emd se hicap、cellufine sulfate、cm和sp trisacryl、cm和s hyperd、s和cmsepharose cl、cm sepharose ff、s和cm captotm、monos、nuvia s、cellufine phosphat、cellufine max-s r、cellufine max-s h、cellufine max dexs-hbp、cellufine maxdexs-virs、toyopearl sulfate 650或heparin sepharose high performance。在一些实施方案中，captos。在一些实施方案中，eshmuno s。在一些实施方案中，mustang s。

27、在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子选自由na+、k+、nh4+、li+、cs+及其组合组成的组。在一些实施方案中，第二溶液的单价阳离子是na+。

28、在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子选自由ca2+、mg2+、zn2+、mn2+、cu2+、fe2+、ba2+、sr2+及其组合组成的组。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子是ca2+。

29、在一些实施方案中，第二溶液具有约5.0至约8.5的ph。在一些实施方案中，第二溶液具有约6.0的ph。

30、在一些实施方案中，第二溶液还包含一种或多种表面活性剂。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂选自由以下各项组成的组：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚氧乙烯二醇叔辛基苯酚醚、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)-脱水山梨醇-单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80))、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、克列莫佛(cremophor)、还原triton n-101、triton x-100及其组合。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。

31、在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂的总量为约0.00w/w25％至约0.0075w/w。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂的总量为约0.005w/w％。

32、在一些方面，添加第二溶液在恒定浓度的一种或多种单价阳离子下进行。

33、在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约5mm至约1500mm。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约30mm。

34、在一些方面，添加第二溶液在恒定浓度的一种或多种二价阳离子下进行。

35、在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约1mm至约30mm。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约2mm。

36、在一些方面，添加第二溶液包括一种或多种单价阳离子的浓度的逐步增加。

37、在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约15mm至约60mm。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约30mm。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约100mm至约300mm。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约200mm。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约500mm至约1500mm。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约1000mm。

38、在一些方面，添加第二溶液包括一种或多种二价阳离子的总浓度的逐步增加。

39、在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的初始总浓度为约1mm至约10mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的中间总浓度为约10mm至约20mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的最终总浓度为约20mm至约30mm。

40、在一些方面，添加第二溶液包括一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加。

41、在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mm至约200mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mm至约80mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mm至约40mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mm至约200mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mm至约80mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mm至约80mm。

42、在一些方面，添加第二溶液包括一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加。

43、在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mm至约30mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mm至约15mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mm至约5mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mm至约30mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mm至约15mm。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mm至约5mm。

44、在某些实施方案中，aav衣壳衍生自由以下各项组成的组：aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、遗传修饰的aav、化学修饰的aav、遗传和化学修饰的aav及其组合。在某些实施方案中，aav衣壳衍生自aav8。在某些实施方案中，aav衣壳衍生自aav9。在某些实施方案中，aav衣壳衍生自aav6。

45、在某些方面，该方法还包括制备免疫吸收柱，其包括以下步骤

46、(a)通过超滤、阴离子交换剂和/或阳离子交换剂浓缩空aav衣壳；

47、(b)将缓冲液交换为无胺缓冲液；和

48、(c)将空aav衣壳固定在活化树脂上。

49、本文还提供了包含根据如本文所述的方法纯化的完整aav衣壳的aav制剂。在某些实施方案中，aav制剂还包含药学上可接受的载体。在某些实施方案中，aav制剂基本上不含空aav衣壳。

50、本文还提供了包含通过本文所述的方法产生的aav产物、制剂或组合物的药物组合物。在某些实施方案中，aav药物组合物还包含药学上可接受的载体。在某些实施方案中，aav药物组合物基本上不含空aav衣壳。