聚合物膜及其制造方法与流程

本公开涉及一种制造聚合物膜、特别是适用于细胞培养装置的聚合物膜的方法。本公开还涉及一种用于细胞培养装置的聚合物膜。本公开进一步地涉及一种包括这种聚合物膜的细胞培养装置，例如流体装置。本公开还进一步地提供了一种细胞培养方法，该细胞培养方法包括用一个或多个这种聚合物膜包裹细胞。

背景技术：

1、对哺乳动物细胞或组织进行体外测试是获取所研究哺乳动物材料的重要临床信息的一项重要技术。例如，可对活检哺乳动物细胞或组织材料进行这种测试，以确定这种哺乳动物材料的异常或疾病，或将患病哺乳动物材料暴露于药物(如实验药物)中，以监测患病哺乳动物材料对这种暴露的反应。例如，该方法经常用于肿瘤治疗过程。这可以提供重要的见解，关于如何有效地治疗个体的疾病，而不必让个体暴露于一系列可能有效的药物(这可能由于诸如药物毒性的多种原因而不可取)。此外，对于目前尚未建立令人满意的药物治疗方法的现有疾病，也可以通过这种方式测试实验性药物的疗效。还有许多其他众所周知的原因需要进行利用体外试验。

2、这种体外测试的常见方法是将哺乳动物材料固定在流体装置中，有时也称为器官芯片(organic-on-chip)。在这种方法中，哺乳动物材料通常被固定在分隔流体装置的两个流体通道的膜上，其中第一通道用于喂养哺乳动物材料，第二通道用于将哺乳动物材料暴露于感兴趣的化学化合物或组合物中(诸如药物治疗)，例如，如前所述，以用于测试药物的疗效和/或毒性。流体装置(或至少其膜)可以由弹性体制成，这样流体装置就可以被切片或切割，以获得包括哺乳动物材料在内的膜切片用于评估目的，如评估哺乳动物材料对暴露于感兴趣的化学化合物或组合物的反应。

3、细胞样本，诸如球状体(spheroids)/类器官体(organoids)和活检样本(biopsies)，通常在孔细胞板中进行研究。在目视检查下用移液管注入和移走流体。球状体/类器官体和活检样本预期会留在孔中。使用活检样本放置在膜上的流体装置是最新的技术实践状态。目前正在开发流体处理协议。流体(如含有细胞营养物质和/或实验药物的流体)会通过这种膜，并有将球状体/类器官体卷走的风险。

4、这种体外测试的另一个挑战是确保哺乳动物材料(如细胞或组织)在流体装置的膜上稳定和正常发育，使得它们在测试过程的持续时间中存活。这在肿瘤学程序中尤其具有挑战性，因为实验的时间可能相当长。为此，可以使用生物相容性材料(诸如纤维连接蛋白)稳定哺乳动物材料，该材料通过为细胞提供模拟天然组织化学环境的化学环境，确保哺乳动物细胞不断繁殖。

5、用于膜的软橡胶或聚合物材料相对是无极性和疏水性的，一般不具有粘附或结合蛋白的功能基团。发现在用于细胞培养的流体装置中实施软橡胶基底或膜通常比较困难且昂贵。还发现，在流体装置中，涂层或额外的细胞基质很容易被冲走。

技术实现思路

1、本发明由权利要求书定义。

2、根据本文公开的一个方面的示例，提供了一种制造适用于细胞培养装置的聚合物膜的方法。该方法包括：在第一聚合物的第一表面上提供：表面活性剂，该表面活性剂包括各自具有极性部分(polar moiety)的表面活性剂分子；以及第二聚合物。该方法还包括将聚合物膜形成为包括至少部分表面活性剂分子和第二聚合物，该聚合物膜具有与第一表面接触的第二表面(207)；第一聚合物、第二聚合物和表面活性剂分子被选择为使得极性部分对第一表面的亲和性大于对第二聚合物的亲和性。

3、表面活性剂分子包括通常与极性较小或非极性部分相连的极性部分，即该极性部分的极性大于该极性较小或非极性部分。极性部分可以是亲水部分，非极性部分可以是疏水部分，这意味着亲水部分比疏水部分更亲水。因此，这种表面活性剂分子可以包括两亲性分子或由两亲性分子构成。

4、由于第一聚合物的至少第一表面(在某些示例中是整体)比第二聚合物对极性部分具有更大的亲和性，因此聚合物膜的第二表面上的多数表面活性剂分子可以被定向为使得极性部分在第二表面上可用(即极性部分位于第二表面上)。极性部分使表面活性剂分子能够在聚合物膜形成之前聚集在第一表面。

5、通过选择极性和/或亲水性(至少在第一表面上)高于第二聚合物的极性和/或亲水性的第一聚合物，可以实现第一聚合物或至少第一聚合物的第一表面对极性部分的亲和性相对于第二聚合物较高。替代地或附加地，可以选择第一聚合物，使其在第一表面与极性部分形成比第二聚合物更强的分子间相互作用(诸如氢键)。因此，除表面活性剂分子的极性部分外，其他部分的粘附对第二聚合物的亲和性优选地高于对第一聚合物的亲和力。

6、通过表面活性剂分子的极性部分在聚合物膜的第二表面上可用的这种方式，第二表面的表面特性可以特别适合于例如细胞培养蛋白(诸如纤维连接蛋白)与之结合。替代地或附加地，第二表面也可直接适用于细胞培养，而无需为其提供培养蛋白。例如，wo2019015988、wo20200148427和wo2021058657中描述了这种功能化或非功能化表面对细胞培养的有用性，这些文件通过引用以其整体并入本文。

7、此外，由于第一聚合物(如箔片或其他主体的形式)被用于实现上述极性部分的定向，因此聚合物膜可以相对直接地从其中释放或移除或分离，例如通过将第一聚合物和聚合物膜彼此剥离，和/或通过将第一聚合物溶解在聚合物膜较难溶解或不溶解的溶剂中，从而使聚合物膜与第一聚合物分离。这为制造具有在其表面可用的极性部分的聚合物膜提供了更便利的方法。

8、此外，该方法还可以有效地制造易碎和相对较薄的聚合物膜(如厚度小于100微米)，而不会使其分解。特别地，在这方面，以溶解为基础移除第一聚合物是有益的，因为它避免了在剥离过程中施加相对较高的拉力。

9、在形成聚合物膜的过程中，表面活性剂分子通过它们不同于极性部分的任何部分与聚合物膜的粘附比与第一表面的粘附更强。因此，在第一聚合物从聚合物膜进行任何释放或分离期间，至少一些表面活性剂分子仍会在第二表面处粘附到聚合物膜，以提供期望和本文描述的效果。在这方面，粘附可以通过非共价和/或共价键合来发生，如本文将进一步说明的那样，后者(共价键合)是优选的。第一和第二聚合物被选择为使得聚合物膜形成后，第二聚合物和/或聚合物膜不会与第一聚合物共价键合。

10、表面活性剂分子可以在提供第二聚合物之前提供到第一表面，如按应用步骤的顺序提供。替代地，它们也可以同时提供，如作为组合物形式的混合物。为此，可以使用任何合适的方法。例如，可以使用溶剂和/或分散剂将它们提供到第一表面。为此，表面活性剂可以包括溶剂或分散剂(它们中的每种都可以是纯溶剂或若干溶剂的混合物)，用于在其中溶解或分散表面活性剂分子。表面活性剂可以旋涂、喷涂或其他方式提供到第一表面。在向第一表面提供表面活性剂后，优选地将溶剂或分散剂从第一表面蒸发或以其他方式将其移除。可以使用用于溶解或分散第二聚合物的溶剂或分散剂将第二聚合物提供到第一表面。溶剂或分散剂可以与表面活性剂的溶剂或分散剂相同，也可以不同。如果表面活性剂分子和第二聚合物被连续提供到第一表面，则第二聚合物溶剂可以有利地被选择为基本不溶解或分散之前提供的表面活性剂分子，使得表面活性剂分子基本保持位于/聚集在第二表面附近，而不是变得分布在整体中并远离聚合物膜的第二表面。但是，如果不需要这样的效果，或者需要整体分布，则不需要这种溶剂区分。表面活性剂和第二聚合物的溶剂和或分散剂可以是相同的。然后，该方法可以包括提供包括表面活性剂、第二聚合物和溶剂或分散剂的组合物。当期望一些表面活性剂分子分布在聚合物膜整体中，而不是主要或仅聚集在其第二表面时，后者可能是有利的。此外，它还减少了步骤数量，提高了制造效率。

11、聚合物膜的形成可以包括蒸发第二聚合物的溶剂或分散剂，和/或可以包括蒸发表面活性剂分子的溶剂或分散剂。在一个示例中，该方法包括：在第一聚合物的第一表面上提供溶液，该溶液包括第二聚合物、表面活性剂和溶剂，其中表面活性剂包括各自具有极性部分的表面活性剂分子；在溶液或分散剂停留在第一表面上时蒸发溶剂，以提供所述聚合物膜，

12、表面活性剂可以包括多种类型的表面活性剂分子，因此表面活性剂分子可以具有不同类型的极性部分和/或不同类型的非极性部分。

13、在某些实施例中，第二聚合物包括弹性体。替代地或附加地，第二聚合物的邵氏a硬度为70或更小，更优选地为60或更小，最优选地为20或更小。当聚合物膜用于细胞培养装置时，这种第二聚合物的变形(如弹性变形)可以特别有利，因为第二聚合物可以抵靠基底和/或盖板进行变形(如弹性变形)，以密封细胞培养装置内的流体。

14、聚合物膜可以包括用于在聚合物膜的一些边缘处至少部分地支撑聚合物膜的框架。这种框架可以由金属或塑料制成。该框架可便于在不破坏膜的情况下对膜进行处理和/或将膜安装在细胞培养装置中。

15、优选地，第二聚合物包括聚二烯或由聚二烯构成，诸如聚丁二烯、聚丁二烯-苯乙烯、聚异戊二烯或丁基橡胶。特别值得一提的是聚丁二烯，由于聚丁二烯的化学和机械特性使其特别适合用于细胞培养装置。替代地或附加地，第二聚合物包括聚硅氧烷或由聚硅氧烷构成。这些类型的第二聚合物通常可以提供弹性体。它们通常也可以是透明的，这对细胞培养膜或装置非常有用。

16、此外，在表面活性剂分子(如其疏水部分)包括不饱和碳-碳键的非限制性示例中，聚丁二烯中包括的不饱和碳-碳键可以提供表面活性剂分子与聚丁二烯第二聚合物接枝(例如共价键合)的位点。

17、更一般地说，该方法还可以包括交联第二聚合物和至少一些表面活性剂分子。表面活性剂分子优选地具有与极性部分不同的一个或多个反应基团(活性基团)，以参与这种交联。优选地，这种一个或多个反应基团被选择为使得它们不与第一聚合物发生反应。此外，第二聚合物还包括一个或多个其他反应基团，它们用于与所述一个或多个反应基团反应以形成交联。优选地，这种基团形成共价键以形成这种交联。

18、第二聚合物可以包括用于辅助交联的添加剂，例如用于催化反应基团和其他反应基团之间的反应的催化剂。下文将描述示例。

19、例如，第二聚合物可以包括一个或多个不饱和碳-碳键。优选地，这种键选自烯基键和炔基键构成的组。更优选地，这种键选自烯基键构成的组。优选地，碳-碳双键不与其他双键共轭。优选地，一个或多个双键包括至少一个末端双键。

20、例如，第二聚合物可以包括不饱和碳-碳键，如乙烯基官能基团(例如在聚丁二烯和/或氢化物官能基团的情况下)，并且至少一些表面活性剂分子各自包括疏水部分中的不饱和碳-碳键(例如在上述不饱和表面活性剂的情况下，诸如不饱和脂肪酸)。在这种非限制性示例中，交联可以通过表面活性剂的不饱和碳-碳键与第二聚合物的不饱和碳-碳键(如乙烯基官能基团和/或氢化物官能基团)之间的反应进行。

21、更一般地说，第二聚合物可以包括选自聚二烯、聚硅氧烷(诸如聚二甲基硅氧烷(pdms))和可选的聚氨酯构成的组的至少一个或由其构成。

22、与上述聚二烯类似，聚硅氧烷也可以具有不饱和碳-碳键(和/或氢化物官能基团)。这可以使聚硅氧烷能够与包括不饱和碳-碳键的表面活性剂分子交联。

23、需要注意的是，在例如聚氨酯第二聚合物的情况下，缺乏不饱和碳-碳键可能意味着该特定第二聚合物不能与包括不饱和碳-碳键的表面活性剂分子形成交联。

24、在某些实施例中，第一聚合物包括一种或多种多元醇(诸如聚乙烯醇)、聚氨酯和聚乙二醇或由其构成。这种第一聚合物(如箔片形式)可从聚合物膜上释放。例如使用剥离或溶解方法。多元醇通常可溶于诸如水或酒精的极性溶剂，而第二聚合物和聚合物膜则不能。

25、该方法可以包括从第一表面释放聚合物膜。这种释放可以以任何合适的方式进行，特别是要注意本文所述的第一聚合物的特性。例如，可以通过剥离和/或溶解第一聚合物来实现这种释放。当使用剥离进行释放时，第一聚合物和第二聚合物被选择为使得它们对彼此不具有高亲和性。例如，第二聚合物被选择为极性小于第一聚合物(如亲水性较低)。当使用溶解进行释放时，释放溶剂被选择为使得其能够溶解第一聚合物，但基本不能溶解聚合物膜。换句话说，至少第二聚合物和第二表面的表面活性剂分子不会被释放溶剂所溶解。优选地，考虑到释放过程中的条件，有利地是使表面活性剂分子与聚合物膜的第二聚合物共价键合。

26、值得注意的是，例如在聚乙烯醇和聚乙二醇作为第一聚合物的情况下，可以使用这种溶解方法，而聚氨酯相对较低的溶解度可能意味着使用从聚合物膜上剥离或剥落聚氨酯第一聚合物来代替溶解。

27、此外，这种聚乙烯醇、聚氨酯或聚乙二醇第一聚合物可以比第二聚合物更具极性和/或与极性部分形成更强的分子间相互作用(诸如氢键)，并且因此对极性部分具有更大的亲和性，例如当第二聚合物是诸如聚丁二烯的聚二烯时。

28、在至少一些实施例中，溶剂包括烃类溶剂、脂肪族烃类溶剂(诸如烷烃溶剂，如庚烷)、醇类溶剂(诸如异丙醇)和酮类溶剂(诸如丙酮)中的一种或多种或由其构成。例如，当第二聚合物包括聚二烯(诸如聚丁二烯)或由其构成时，溶剂包括庚烷或由庚烷构成。

29、极性部分可以是勃朗斯特-洛里(bronsted-lowry)酸/碱。这些包括能够与本领域已知的适当共轭碱交换质子的酸。

30、极性部分可以是羧酸基团、磷酸基团、亚磷酸基团、磺酸基团、胺基团或酰胺基团。优选地，极性部分可以是羧酸基团、磷酸基团、亚磷酸基团、胺基团或酰胺基团。更优选地，极性部分是羧酸基团、胺基团或酰胺基团。这些官能基团可以与细胞培养蛋白相互作用，例如与其共价键合。此外，这些基团还可以允许在不与细胞培养蛋白共价键合的情况下进行细胞培养。例如，在细胞培养过程中，它们可以使细胞培养基质中存在和/或形成的细胞培养蛋白粘附到它们上面。例如请参考wo 2019015988、wo20200148427和wo2021058657。

31、极性部分可以是选自羧酸基团、磷酸基团和亚磷酸基团构成的组的一个或多个酸性基团。

32、非极性部分可以包括选自直链和支链烃链(诸如脂肪族链)以及直链和支链聚醚链构成的组的一个或多个基团。

33、非极性部分优选地包括能够与第二聚合物形成共价键的一个或多个反应基团。因此，这种反应基团的极性小于极性部分。所述一个或多个反应基团优选地选自酰亚胺、羰基、烯基(诸如乙烯基)、炔基构成的组，所有这些都可以作为末端和/或非末端基团存在，与非末端基团相比，后者有时在提高反应性方面是优选的。优选地，这些基团是非共轭的。

34、在某些实施例中，表面活性剂包括脂肪酸，其中脂肪酸的羧酸基团限定极性部分。

35、在表面活性剂包括脂肪酸的实施例中，脂肪酸可以包括不饱和脂肪酸或由不饱和脂肪酸构成。例如，这种脂肪酸的不饱和碳-碳键可以用于将不饱和脂肪酸与第二聚合物交联，例如通过上述涉及第二聚合物中包括的不饱和碳-碳键和/或氢化物官能基团的反应。

36、不饱和脂肪酸可以是选自十四碳烯酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、反式油酸、反式十八碳烯酸、亚油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸中的一种或多种。特别值得一提的是亚油酸，如α-亚麻酸。作为含乙烯基的非饱和脂肪酸，十一碳-10-烯酸可以作为一个优选的示例。

37、该方法可以包括分离聚合物膜和第一聚合物。这种分离可以以任何合适的方式进行。例如，分离可以包括将第一聚合物从聚合物膜上分层(如剥离)，和/或将第一聚合物溶解在聚合物膜不易溶解或不溶解的溶剂中，从而将聚合物膜与第一聚合物分离。使用溶解的方法对于易碎的聚合物膜(诸如薄膜)是有利的。

38、至少在某些实施例中，该方法包括在聚合物膜中形成一个或多个孔洞和/或凹槽。这些凹槽和/或孔洞可帮助聚合物膜在例如细胞培养装置中实现某种功能，诸如使得能够通过凹槽和/或孔洞向细胞供应营养物质，从细胞中清除废物，和/或使得能够监测细胞样本。

39、孔洞210的大小/直径可以根据最实际的情况(如用于处理和/或显微镜检查的情况)来选择。例如，这种孔洞的直径可以在1-1000μm范围内，优选地在1-100μm范围内，更优选地在1-20μm范围内，甚至1-10μm范围内。

40、孔洞和/或凹槽的形成可以包括对聚合物膜进行激光钻孔。这可以在移除第一聚合物之前进行，也可以在之后进行。因此，本文公开的任何方法都可以包括使用飞秒或皮秒激光进行激光烧蚀，在聚合物膜中形成一个或多个孔洞和/或凹槽。优选地，在这种情况下，孔洞和/或凹槽包括在聚合物膜的平面上测量的在小于50微米，优选地小于20微米的范围内的至少一个开口尺寸。在某些示例中，飞秒或皮秒激光的波长在400nm到1200nm之间。优选地，激光钻孔的聚合物膜包括选自聚丁二烯和聚硅氧烷构成的组的聚合物，聚合物膜的厚度小于100微米。

41、需要注意的是，本文所述的用于形成孔洞或凹槽的激光钻孔方法可以独立于本文所述的聚合物膜的制作方法使用。因此，以其他方式制成的聚合物膜(优选地厚度小于100微米，优选地包括聚硅氧烷和/或聚丁二烯)也可以按本文所述进行激光钻孔。

42、在其他实施例中，孔洞和/或凹槽的形成可以包括使用第一聚合物在第一表面的浮雕作为模具，用于在聚合物膜内在第二表面上形成浮雕。因此，一旦聚合物膜从第一表面释放下来，第一表面就可以具有浮雕，使其包括在聚合物膜中限定例如孔洞和/或凹口的突起。包括浮雕的第一表面可以具有用于在第一聚合物的第二表面中限定凹口(而不是孔)的突起。因此，这样的第一表面可用于将第二表面制备成带有凹口的浮雕表面，以代替或补充聚合物膜中的孔。在细胞培养过程中，这些凹口可以提供特定的功能。一个示例就是在凹口中生长类器官体。第一表面可以被选择为具有浮雕表面，该浮雕表面具有一个或多个突起，用于在聚合物膜的第二表面中限定带有一个或多个孔洞的凹口。

43、在某些实施例中，该方法包括用细胞培养蛋白(如人体蛋白)对聚合物膜的第二表面进行功能化处理。在第二表面可用的上述极性部分可促进这种功能化。例如，通过与蛋白进行极性相互作用或共价键合。

44、例如，细胞培养蛋白可以包括胶原蛋白、弹性蛋白和纤维连接蛋白中的一种或多种或由其构成。在纤维连接蛋白的情况下，这种蛋白可以直接与极性部分偶联，特别是在极性部分为羧酸基团的示例下。

45、在某些实施例中，该方法包括提供具有一个或多个空腔的细胞培养装置主体，并在一个或多个空腔中的至少一些空腔中安装一个或多个聚合物膜。优选地，这种安装使得一个或多个空腔中的至少一些空腔中的每一个被聚合物膜分隔成第一空腔和第二空腔。优选地，细胞培养装置主体包括与第一和/或第二空腔相连的第一和/或第二流体通道。优选地，聚合物膜在其外周被框架支撑。主体可以是例如由聚苯乙烯制成的孔细胞板(如多孔板)。主体可以是例如由pdms制成的弹性体。该方法可以包括将弹性体夹在诸如由玻璃制成的盖板之间。wo2019015988和wo2021058657中公开了如流体装置形式的细胞培养装置的示例，这两个文件通过引用以其整体并入本文。

46、根据另一方面，提供了一种可通过上面定义的方法获得的聚合物膜。

47、根据又一方面，提供了一种细胞培养装置，该细胞培养装置包括流体装置或者是流体装置的形式，该装置包括一个或多个根据本公开的聚合物膜。流体装置被理解为包括至少一个通道，用于允许或提供朝向和/或远离聚合物膜的流体流。在某些实施例中，流体装置包括通过聚合物膜与第二空腔隔开的第一空腔。优选地，存在与第一空腔相连的第一流动通道和与第二空腔相连的第二流动通道，每个流动通道具有一个或多个开口，用于向流体装置提供外部流体流。这种膜分隔空腔可以有多种组合。可以使用相同的第一流体通道连接多个第一空腔和/或可以使用相同的第二流体通道连接多个第二空腔。

48、这种细胞培养装置或流体装置的示例基于wo2019015988和wo2021058657中公开的设计，其中膜现在已被当前公开内容的那些膜所取代，如通过将这种膜安装在本公开设计的空腔中。

49、根据又一方面，提供了一种细胞培养装置，其包括：聚合物膜和另一聚合物膜，所述聚合物膜具有与所述另一聚合物膜的另一表面相对的表面，其中聚合物膜中的至少一个包括表面活性剂，表面活性剂包括各自在相应(一个或两个)表面上具有极性部分的表面活性剂分子。细胞培养装置可以包括流体装置或由流体装置构成。

50、以这种方式将细胞包裹在聚合物膜之间可以降低向流体装置提供流体和/或从流体装置抽出流体时，这些细胞(如活检样本或球状体/类器官体的细胞)被冲走的风险。

51、例如，聚合物膜中的一个或两个可以是光学透明的，以便能够对流体装置位于聚合物膜之间的内部进行光学分析。例如，可以使用合适的显微镜进行这种光学分析。

52、细胞培养蛋白可以通过极性部分与所述一个或两个表面结合，例如通过细胞培养蛋白与极性部分的共价键合。

53、聚合物膜中的一个或优选地两个可以包括一个或多个凹槽和/或孔洞。例如，这种孔洞的直径可以在1-1000μm的范围内。优选地，在1-100μm或1-50μm的范围内。更优选地，在1-20μm的范围内。

54、例如，可以针对细胞样本或细胞样本的类型，根据细胞和/或细胞层和/或球状体/类器官体和/或活检样本的尺寸，对一个或两个膜中的孔洞进行优化。

55、在一个非限制性示例中，两个聚合物膜由相同聚合物(例如聚二烯，诸如聚丁二烯)制成。

56、根据另一个方面，提供了一种细胞培养方法，该方法包括使用根据本公开的至少一个聚合物膜将细胞固定在细胞培养装置内。该固定可以包括使用聚合物膜固定和/或部分或全部地包裹细胞。

57、更一般地说，本文所述与聚合物膜、流体装置和细胞培养方法有关的实施例可适用于制造聚合物膜的方法，本文所述与制造聚合物膜的方法有关的实施例可适用于聚合物膜本身以及流体装置和细胞培养方法。

58、本发明的这些和其他方面将从下文所述的一个或多个实施例中显而易见，并将参照这些实施例加以阐明。