修饰型转谷氨酰胺酶的制作方法

本发明涉及修饰型转谷氨酰胺酶。更具体而言，本发明涉及通过获得在50℃以上的任意温度下的高反应性的突变而被修饰的转谷氨酰胺酶。

背景技术：

1、转谷氨酰胺酶是在多肽中催化谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基的酰基转移反应的酶，通过使赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体发挥作用，在多肽链的分子内或分子间形成ε-(γ-gln)-lys交联键。

2、即，转谷氨酰胺酶能够通过使蛋白质或肽交联而进行改性。具体而言，来源于链霉菌属的转谷氨酰胺酶(例如参照专利文献1)用于肉的粘结以及香肠、豆腐、面包和面条类的制造。另外，不限于食品领域，还研究了在纤维领域、医疗领域、香味化妆品领域等中的转谷氨酰胺酶的利用。期待这样高的可用性，因此尝试了用于提高转谷氨酰胺酶具有的各特性(耐热性、比活性、底物特异性、稳定性等)的改良(例如参照专利文献2～4、非专利文献1～4)。

3、现有技术文献

4、专利文献

5、专利文献1：日本特开平4-108381号公报

6、专利文献2：日本特开2002-253272号公报

7、专利文献3：日本特开2008-194004号公报

8、专利文献4：国际公开第2019/107288号单行本

9、非专利文献

10、非专利文献1：marx ck et al.,j.biotechnol.2008sep 10；136(3-4):156-162.

11、非专利文献2：tagami u et al.,protein eng.des.sel.2009dec；22(12):747-752.

12、非专利文献3：yokoyama k et al.,appl.microbiol.biotechnol.(2010)87:2087-2096.

13、非专利文献4：buettner k et al.,amino acids.2012feb；42(2-3):987-996.

技术实现思路

1、发明所要解决的技术问题

2、如上所述，迄今为止，对于转谷氨酰胺酶，以提高其各特性为目的而尝试了改良，但鉴于因其高的有用性而期待的用途的进一步扩大的可能性等，期望改良转谷氨酰胺酶的新的选项。特别是在转谷氨酰胺酶的产业上利用中大多使用加热条件，在加热温度区域中的高反应性能够成为特别有用的特性。

3、因此，本发明的目的在于提供加热温度区域中的反应性提高的修饰型转谷氨酰胺酶。

4、用于解决技术问题的技术方案

5、本发明人进行了深入研究，其结果，作为使转谷氨酰胺酶具备在加热温度区域中的提高的反应性的新突变，发现了(i)序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合替换为特定的三氨基酸残基的组合；(ii)第243位～第245位的三氨基酸残基的组合替换为特定的三氨基酸残基的组合；和/或，(iii)第2位的氨基酸残基替换为特定的氨基酸残基。本发明是基于该见解完成的。即，本发明提供下述揭示的方式的发明。

6、项1.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其包含以下(i-1)～(i-3)中任一项所示的多肽：

7、(i-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为下述表1的(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列，

8、[表1]

9、

10、(i-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，导入有所述替换的三氨基酸残基的组合以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第249位～第251位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，

11、(i-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括导入有所述替换的三氨基酸残基的组合的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第249位～第251位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。

12、项2.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其包含以下(ii-1)～(ii-3)中任一项所示的多肽：

13、(ii-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为以下表2的(42)～(60)中任一个所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列，

14、[表2]

15、

16、(ii-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，导入有所述替换的三氨基酸残基的组合以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第243位～第245位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，

17、(ii-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括导入有所述替换的三氨基酸残基的组合的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第243位～第245位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。

18、项3.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其包含以下(iii-1)～(iii-3)中任一项所示的多肽：

19、(iii-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第2位的氨基酸残基被替换为(61)l或(62)f的氨基酸序列，

20、(iii-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第2位氨基酸残基被替换为所述(61)或(62)的氨基酸残基的氨基酸序列中，所述第2位氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第2位的氨基酸残基未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，

21、(iii-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第2位的氨基酸残基被替换为所述(61)或(62)的氨基酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括所述第2位的氨基酸残基的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第2位的氨基酸残基未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。

22、项4.一种dna，其编码项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。

23、项5.一种表达盒或重组载体，其包含项4所述的dna。

24、项6.一种转化体，其是通过项5所述的表达盒或重组载体对宿主进行转化而得到的。

25、项7.一种项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶的制造方法，其包括培养项6所述的转化体的工序。

26、项8.一种酶制剂，其包含项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。

27、项9.一种蛋白质材料的改性剂，其包含项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。

28、项10.一种改性的蛋白质材料的制造方法，其包括使项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶作用于蛋白质材料的工序。

29、项11.根据项10所述的制造方法，其中，所述蛋白质材料为食用的。

30、发明效果

31、根据本发明，提供在加热温度区域中的反应性提高的修饰型转谷氨酰胺酶。