基因修饰多能干细胞、来自其的免疫活性细胞、它们的制造方法和它们的用途与流程

本发明涉及经基因修饰的多能干细胞、来自该多能干细胞的免疫活性细胞、它们的制造方法和它们的用途等。更详细而言，本发明涉及为了细胞免疫疗法而强化了功能的基因修饰多能干细胞、来自该多能干细胞的自然杀伤(nk)细胞或其前体细胞、包括向多能干细胞导入用于功能强化的外源基因的它们的制造方法、以及它们作为细胞药物的用途等。

背景技术：

1、作为参与癌免疫的细胞，可举出t细胞等淋巴细胞、nk细胞、自然杀伤t(nkt)细胞等，使用这些免疫细胞的细胞疗法的研究开发具有半世纪以上的历史。近年来，通过ips细胞和分化诱导法的开发、ips细胞的基因修饰法等的技术发展，对ips细胞进行基因修饰，分化诱导为目标免疫细胞，由此可以制造赋予了高功能的免疫细胞。籍此，可以构建使用免疫细胞的各种治疗策略。

2、作为与这种基因修饰免疫细胞相关的细胞药品，目前批准有以cd19为靶标的基于car-t细胞的药品(kymriah和yescarta)。另一方面，nk细胞对癌细胞无需预致敏，且能够不受抗原识别约束地应答。nk细胞在直接识别并杀伤靶细胞的同时，通过产生各种细胞因子使t细胞、巨噬细胞等活化，具有提高免疫功能的作用。另外，nk细胞与t细胞不同，即使使用hla类型不完全匹配的供体细胞也不易产生gvhd等的问题，进而还难以引起作为t细胞所致副作用的细胞因子释放综合征(crs)。因此，从最近的t细胞疗法的临床良好结果来看，对于使用同样是抗肿瘤效应细胞的nk细胞的免疫细胞疗法的期待也在提高。

3、实际上，存在以使用修饰nk细胞的细胞药品为对象的各种临床试验(非专利文献1)。例如fate therapeutics公司以实体癌为对象开发了敲除(ko)cd38且表达il-15·il-15受体融合蛋白和cd16的来自ips细胞的修饰nk细胞(例如，专利文献1)。武田药品工业株式会社与德克萨斯大学md安德森癌症中心共同开发了表达il-15的cd19-carnk细胞(例如，非专利文献2)。但是，被当局批准的药品尚不存在。

4、作为nk细胞中使用的功能强化因子，已知有在上述fate therapeutics公司、武田药品工业株式会社的开发品中导入的il-15、cd16等。已知il-15在使nk细胞自身增殖·活化的同时，还具有使周围的t细胞活化的功能(非专利文献3－5)。另外，已知cd16通过在nk细胞表面表达而有助于nk细胞介导的抗体依赖性细胞毒活性(adcc)作用(非专利文献6)。因此，使在nk细胞中的功能已广为人知的这些因子在nk细胞中表达并进一步强化其功能的尝试已经在以上述fate therapeutics公司、武田药品工业株式会社的开发品为代表的各种修饰nk细胞中被采用。

5、另一方面，也尝试了通过使各种趋化因子·趋化因子受体在免疫细胞中表达来提高其迁移能力，从而提高对癌细胞的攻击能力。例如专利文献2中公开了使用了表达ccr2等各种趋化因子·趋化因子受体的t细胞的癌症免疫疗法。另外，专利文献3中公开了通过使ccl19与各种白介素一起表达，从而使t细胞的抗肿瘤活性得到增强，增殖性提高。进一步，专利文献4中公开了表达免疫活性因子的car免疫细胞，作为car免疫细胞还记载了nk细胞也成为对象。另外，作为免疫活性因子，还列举了il-15和ccr2b。

6、但是，这些公开至多涉及在t细胞等免疫细胞中表达该因子而强化它们的功能的方法，并不是利用基因修饰ips细胞的方法。另外，任一文献中均未暗示或记载将ccr2b和ccl19组合并导入nk细胞。

7、现有技术文献

8、专利文献

9、专利文献1：wo 2019/126748

10、专利文献2：wo 2018/152572

11、专利文献3：wo 2020/045610

12、专利文献4：wo 2017/133633

13、非专利文献

14、非专利文献1：nat rev drug discov.2020mar；19(3):200-218

15、非专利文献2：n engl j med.2020feb 6；382(6):545-553

16、非专利文献3：j exp med.1994oct 1；180(4):1395-1403

17、非专利文献4：cancer immunnol immunother.2012sep；61(9):1451-1461

18、非专利文献5：nat rev immunnol.2003apr；3(4):269-279

19、非专利文献6：front immunnol.2015jul 27；6:368

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、需要作为进一步的治疗上的选项的基因修饰免疫细胞。因此，本发明的目的在于提供具有高功能的基因修饰免疫活性细胞、特别是来自ips细胞等多能干细胞的基因修饰nk细胞。

3、用于解决课题的手段

4、本发明人等为了达成上述目的而想到使趋化因子·趋化因子受体在nk细胞中高表达。因此，在数目众多的趋化因子·趋化因子受体之中，分别选择ccr2b作为趋化因子受体、ccl19作为趋化因子，通过基因修饰将它们外源性地导入ips细胞。将该ips细胞分化诱导为nk细胞并对其功能进行验证时，发现该修饰nk细胞发挥设想以上的高功能。已知在免疫细胞中，包含趋化因子的细胞因子对于癌免疫有时具有两面性，例如，ccl2可以促进免疫抑制细胞的动员，抑制t细胞的功能(例如，cancerlett2007 jul 8；252(1):86-92.)。即，即使组合多种趋化因子·趋化因子受体，是否能够得到所期待的奖励效果也是完全的未知数，本发明等所发现的该见解是出人意料的。

5、本发明人等基于该见解进一步反复研究，结果完成了本发明。

6、即，本发明如下所述。

7、项目[1]

8、多能干细胞、或者来自该多能干细胞的nk细胞或其前体细胞，所述多能干细胞表达以下的(a)和(b)：

9、(a)编码cc趋化因子受体2型b(ccr2b)的外源基因；

10、(b)编码cc趋化因子配体19(ccl19)的外源基因。

11、项目[2]

12、根据项目[1]所述的细胞，其进一步表达以下的(c)和/或(d)：

13、(c)编码白介素15(il-15)的外源基因；

14、(d)编码cd16的外源基因。

15、项目[3]

16、根据项目[1]或[2]所述的细胞，其进一步表达以下的(e)：

17、(e)编码nkg2d或nkg2d-car的外源基因。

18、项目[4]

19、根据项目[3]所述的细胞，其中，(e)为编码nkg2d-car的外源基因。

20、项目[5]

21、根据项目[3]所述的细胞，其中，(e)为编码nkg2d的外源基因，且其进一步共表达(f)编码dap10的外源基因。

22、项目[6]

23、根据项目[2]～[5]中任一项所述的细胞，其表达编码il-15的外源基因，该il-15为分泌型il-15。

24、项目[7]

25、根据项目[2]～[5]中任一项所述的细胞，其表达编码il-15的外源基因，且共表达编码il-15受体α(il-15rα)的外源基因。

26、项目[8]

27、根据项目[2]～[7]中任一项所述的细胞，其表达编码cd16的外源基因，该cd16为具有高亲和性突变或非截断突变的cd16。

28、项目[9]

29、根据项目[8]所述的细胞，其中，cd16具有选自f176v(f158v)和s197p的突变。

30、项目[10]

31、药物，其包含项目[1]～[9]中任一项所述的细胞。

32、项目[11]

33、根据项目[10]所述的药物，其为癌症的治疗药。

34、项目[12]

35、制造癌组织归巢功能和免疫活性细胞动员功能被强化的基因修饰细胞的方法，其包括向多能干细胞导入以下的(a)和(b)：

36、(a)编码ccr2b的外源基因；

37、(b)编码ccl19的外源基因。

38、项目[13]

39、根据项目[12]所述的方法，其进一步包括将导入有所述外源基因的多能干细胞分化诱导为nk细胞或其前体细胞。

40、项目[14]

41、用于制造基因修饰细胞的构建体，其包含以下的(a)和(b)：

42、(a)编码ccr2b的外源基因；

43、(b)编码ccl19的外源基因。

44、项目[15]

45、根据项目[14]所述的构建体，其中，外源基因包含于单独的构建体中。

46、项目[16]

47、表达盒，其包含基因表达控制区域和在该控制区域的控制下的项目[14]或[15]所述的构建体。

48、项目[17]

49、载体，其包含项目[16]所述的表达盒。

50、项目[18]

51、根据项目[17]所述的载体，其具备表达盒被夹在一对转座子反向重复序列之间的结构。

52、项目[19]

53、基因修饰细胞的制作试剂盒，其包含项目[18]所述的载体和转座酶表达载体，且表达以下的(a)和(b)：

54、(a)编码ccr2b的外源基因；

55、(b)编码ccl19的外源基因。

56、项目[20]

57、根据项目[19]所述的试剂盒，其中，转座酶为piggybac转座酶。

58、项目[21]

59、癌症的治疗方法，其包括向癌症患者给药项目[1]～[9]中任一项所述的细胞。

60、项目[22]

61、项目[1]～[9]中任一项所述的细胞在用于治疗癌症的方法中的用途。

62、项目[23]

63、项目[1]～[9]中任一项所述的细胞在制造用于癌症治疗的药物中的用途。

64、发明效果

65、本发明的修饰nk细胞或其前体细胞来自导入了用于强化特别是以癌免疫为目的的功能的基因的多能干细胞，通过表达ccr2b和ccl19而具有比以往的细胞更优异的癌组织归巢功能、动员t细胞等免疫活性细胞的功能，具有高抗肿瘤活性。另外，通过使cd16高表达，抗体依赖性细胞毒活性增强、或者通过表达il-15、进而表达il-15受体α，持续性、增殖性等也提高。另外，通过使nkg2d(-car)和dap10高表达，带来nkg2d配体刺激的活化信号的增强。

66、所以，通过使用本发明的修饰nk细胞或其前体细胞，可以提高免疫疗法的治疗效果。进一步，本发明的修饰nk细胞或其前体细胞不仅可能参与nk细胞其自身的活化，而且还可能参与周围的t细胞等免疫细胞的活化，因此可能对现存治疗法中效果有限的疾病的治疗有用。

67、另外，本发明的修饰nk细胞或其前体细胞通过分化诱导基因修饰多能干细胞而得到，因此与对nk细胞进行基因修饰而得的细胞相比，可以更容易地制造大量的修饰nk细胞或其前体细胞。

68、根据本发明的规定的因子的组合，对于全部免疫细胞，不仅是如上所述的nk细胞，而且在t细胞、单核细胞/巨噬细胞、树状细胞等中导入基因并表达的情况下，也可以得到抗肿瘤活性高的各种修饰免疫细胞。