靶向CD47/4-1BB的蛋白质复合物和其使用方法与流程

本公开涉及靶向cd47和4-1bb的蛋白质复合物和其使用方法。

背景技术：

1、信号调节蛋白α(sirpα)为sirp家族中的调节性膜糖蛋白。其主要由髓系细胞表达并且还由干细胞或神经元表达。sirpα充当抑制性受体并且与广泛表达的跨膜蛋白cd47相互作用。这种相互作用负向控制固有免疫细胞的效应子功能，如宿主细胞吞噬。sirpα在巨噬细胞膜上横向扩散并且聚集在吞噬突触处以与cd47结合，这抑制由巨噬细胞进行的细胞骨架密集型吞噬过程。

2、cd47通过与信号调节蛋白α(sirpα)的n末端结合提供“别吃”信号。已发现cd47在许多不同肿瘤细胞中过表达。靶向cd47和/或sirpα可用于癌症免疫疗法。然而，由于cd47也在红细胞(rbc)和血小板上表达，因此抑制cd47/sirpα相互作用可能导致rbc和血小板的吞噬。因此，需要开发靶向cd47/sirpα通路的毒性有限的癌症疗法。

技术实现思路

1、本公开涉及靶向cd47和4-1bb的蛋白质复合物和其使用方法。

2、一方面，本公开涉及一种蛋白质复合物，其包括：(a)fc；(b)cd47结合结构域；以及(c)4-1bb(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)结合结构域。

3、在一些实施例中，所述cd47结合结构域可以与表达cd47的细胞(例如，癌细胞)结合和/或阻断cd47与信号调节蛋白α(sirpα)之间的相互作用。在一些实施例中，所述cd47结合结构域为或包括sirpα胞外结构域。在一些实施例中，所述sirpα胞外结构域为人sirpα胞外结构域。在一些实施例中，所述cd47结合结构域包括与seq id no:6至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

4、在一些实施例中，所述4-1bb结合结构域可以与表达4-1bb的免疫细胞(例如，t细胞)结合和/或可以刺激t细胞激活和增殖。在一些实施例中，所述4-1bb结合结构域为或包括4-1bbl胞外结构域。在一些实施例中，所述4-1bbl胞外结构域为人4-1bbl胞外结构域。在一些实施例中，所述4-1bb结合结构域包括与seq id no:7、8或9至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

5、在一些实施例中，所述fc为人igg4 fc。

6、在一些实施例中，所述cd47结合结构域与所述fc中的ch2结构域的n末端连接，任选地通过铰链区。在一些实施例中，所述4-1bb结合结构域与所述fc中的ch2结构域的n末端连接，任选地通过铰链区。在一些实施例中，所述铰链区为人igg4铰链区，所述人igg4铰链区任选地具有根据eu编号的s228p突变。在一些实施例中，所述4-1bb结合结构域与所述fc中的ch3结构域的c末端连接，任选地通过接头肽。在一些实施例中，所述fc包括第一ch3结构域和第二ch3结构域，在一些实施例中，任意一个或两个ch3结构域包括一个或多个选自以下的氨基酸残基：360e、409w、347r、399v和405t(eu编号)。

7、在一些实施例中，所述蛋白质复合物包括两个或更多个cd47结合结构域。在一些实施例中，所述蛋白质复合物包括两个或更多个4-1bb结合结构域。

8、一方面，本公开涉及一种蛋白质复合物，其包括：(a)第一多肽，所述第一多肽从n末端到c末端包括：第一cd47结合结构域、任选第一铰链区、第一fc区、任选第一接头肽、第一4-1bb结合结构域和第二4-1bb结合结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽从n末端到c末端包括：第二cd47结合结构域、任选第二铰链区、第二fc区、任选第二接头肽和第三4-1bb结合结构域。在一些实施例中，所述第一cd47结合结构域和/或所述第二cd47结合结构域包括与seq id no:6至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一4-1bb结合结构域、所述第二4-1bb结合结构域和/或所述第三4-1bb结合结构域包括与seq idno:7至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包括与seq id no:18至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述第一fc区包括与seq id no:20至少80％相同的序列，并且所述第二fc区包括与seq id no:21至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一接头肽和/或所述第二接头肽包括与seq id no:13至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述第一4-1bb结合结构域和所述第二4-1bb结合结构域通过第三接头肽连接，在一些实施例中，所述第三接头肽包括与seq id no:14至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述第一多肽包括与seq idno:1至少80％、90％、95％或100％相同的序列，并且所述第二多肽包括与seq id no:2至少80％、90％、95％或100％相同的序列。

9、一方面，本公开涉及一种蛋白质复合物，其包括：(a)第一多肽，所述第一多肽从n末端到c末端包括：第一cd47结合结构域、任选第一铰链区、第一fc区、任选第一接头肽和第一4-1bb结合结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽从n末端到c末端包括：第二cd47结合结构域、任选第二铰链区、第二fc区、任选第二接头肽和第二4-1bb结合结构域。在一些实施例中，所述第一cd47结合结构域和/或所述第二cd47结合结构域包括与seq id no:6至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一4-1bb结合结构域和/或所述第二4-1bb结合结构域包括与seq id no:8至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包括与seq id no:18至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述第一fc区和所述第二fc区包括与seq id no:19至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一接头肽和/或所述第二接头肽包括与seq id no:15至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述第一多肽包括与seq idno:3至少80％、90％、95％或100％相同的序列，并且所述第二多肽包括与seq id no:3至少80％、90％、95％或100％相同的序列。

10、一方面，本公开涉及一种蛋白质复合物，其包括：(a)第一多肽，所述第一多肽从n末端到c末端包括：第一cd47结合结构域、第二cd47结合结构域、任选第一铰链区和第一fc区；以及(b)第二多肽，所述第二多肽从n末端到c末端包括：第一4-1bb结合结构域、第二4-1bb结合结构域、第三4-1bb结合结构域、任选第二铰链区和第二fc区。在一些实施例中，所述第一cd47结合结构域和/或所述第二cd47结合结构域包括与seq id no:6至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一4-1bb结合结构域、所述第二4-1bb结合结构域和/或所述第三4-1bb结合结构域包括与seq id no:9至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包括与seqid no:18至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述第一fc区包括与seq id no:20至少80％相同的序列，并且所述第二fc区包括与seq id no:21至少80％、90％、95％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一cd47结合结构域和所述第二4-1bb结合结构域通过第一接头肽连接，在一些实施例中，所述第一接头肽包括与seq id no:14至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述第一4-1bb结合结构域和所述第二4-1bb结合结构域通过第二接头肽连接，并且所述第二4-1bb结合结构域和所述第三4-1bb结合结构域通过第三接头肽连接，在一些实施例中，所述第二接头肽和/或所述第三接头肽包括与seq id no:16至少80％相同的序列。在一些实施例中，所述第一多肽包括与seq id no:4至少80％、90％、95％或100％相同的序列，并且所述第二多肽包括与seq id no:5至少80％、90％、95％或100％相同的序列。

11、在一些方面，本公开涉及一种核酸，其包括编码本文所述的蛋白质复合物的多核苷酸。在一些实施例中，所述核酸为dna(例如，cdna)或rna(例如，mrna)。

12、一方面，本公开涉及一种载体，其包括本文所述的核酸中的一种或多种核酸。

13、一方面，本公开涉及一种细胞，其包括本文所述的载体。在一些实施例中，所述细胞为cho细胞。一方面，本公开涉及一种细胞，其包括本文所述的核酸中的一种或多种核酸。

14、一方面，本公开涉及一种产生蛋白质复合物的方法，所述方法包括(a)在足以使本文所述的细胞产生所述蛋白质复合物的条件下培养所述细胞；以及(b)收集由所述细胞产生的所述蛋白质复合物。

15、一方面，本公开涉及一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包括本文所述的蛋白质复合物，所述抗体-药物缀合物与治疗剂共价结合。在一些实施例中，所述治疗剂为细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。

16、一方面，本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包括本文所述的蛋白质复合物的组合物或本文所述的抗体-药物缀合物。在一些实例中，所述受试者具有表达cd47的癌细胞。在一些实施例中，所述癌症为卵巢癌、头颈鳞状细胞癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、白血病、乳腺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤或结直肠癌。

17、一方面，本公开涉及一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的包括本文所述的蛋白质复合物的组合物或本文所述的抗体-药物缀合物接触。

18、一方面，本公开涉及一种杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的包括本文所述的蛋白质复合物的组合物或本文所述的抗体-药物缀合物接触。

19、一方面，公开涉及一种药物组合物，其包括本文所述的蛋白质复合物以及药学上可接受的载体。

20、如本文所用，术语“蛋白质复合物”或“蛋白质构建体”是指具有一种或多种多肽的复合物。在一些实施例中，所述蛋白质复合物具有两种或更多种多肽，其中所述多肽可以彼此缔合，由此形成二聚体或多聚体。

21、如本文所用，术语“cd47结合结构域”是指可以与cd47结合的蛋白质结构域。在一些实施例中，所述cd47结合结构域可以为抗cd47抗体、其抗原结合片段(例如，scfv或vhh)或cd47结合蛋白或其部分。在一些实施例中，所述cd47结合结构域可以具有一个或多个自稳定结构域。在一些实施例中，所述cd47结合结构域包括sirpα胞外结构域或由其组成。所述sirpα可以为野生型sirpα、人sirpα、源自野生型sirpα的多肽(例如，具有突变)或其一部分(例如，sirpα的胞外区或sirpα的igv结构域)。在一些实施例中，源自野生型sirpα的多肽可以具有一个或多个突变。在一些实施例中，所述sirpα胞外结构域包括sirpα的基本上整个胞外区或其变体或由其组成。在一些实施例中，所述sirpα胞外结构域包括sirpα的igv结构域或其变体或由其组成。在一些实施例中，所述igv结构域具有一个或多个突变。在一些实施例中，所述sirpα胞外结构域具有一个或多个突变。

22、如本文所用，术语“4-1bb结合结构域”是指可以与4-1bb结合的蛋白质结构域。在一些实施例中，所述4-1bb结合结构域可以为抗4-1bb抗体、其抗原结合片段(例如，scfv或vhh)或4-1bb结合蛋白或其部分。在一些实施例中，所述4-1bb结合结构域可以具有一个或多个自稳定结构域。在一些实施例中，所述4-1bb结合结构域包括4-1bbl胞外结构域或由其组成。所述4-1bbl可以为野生型4-1bbl、人4-1bbl、源自野生型4-1bbl的多肽(例如，具有突变)或其一部分(例如，4-1bbl的胞外区)。在一些实施例中，源自野生型4-1bbl的多肽可以具有一个或多个突变。在一些实施例中，所述4-1bbl胞外结构域包括4-1bbl的基本上整个胞外区或其变体或由其组成。在一些实施例中，所述4-1bbl胞外结构域包括4-1bbl的胞外区的一部分或其变体。在一些实施例中，所述4-1bbl胞外结构域具有一个或多个突变。

23、如本文所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞。此类细胞的实例包含具有以使细胞生长迅速激增为特征的异常状态或状况的细胞。所述术语意在包含癌性生长，例如肿瘤；致癌过程、转移性组织和恶性转化细胞、组织或器官，而不论组织病理学类型或侵袭性阶段。还包含各种器官系统的恶性肿瘤，如呼吸系统、心血管系统、肾脏系统、生殖系统、血液系统、神经系统、肝脏系统、胃肠道系统和内分泌系统；以及腺癌，其包含恶性肿瘤，如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺非小细胞癌和小肠癌。“自然出现”的癌症包含不是通过将癌细胞移植到受试者体内来实验性诱导的任何癌症，并且包含例如自发出现的癌症、由于患者暴露于致癌物质所引起的癌症、由插入转基因致癌基因或敲除肿瘤抑制基因而引起的癌症以及由于感染，例如病毒感染，所引起的癌症。术语“癌(carcinoma)”是本领域公认的并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤。术语还包含癌肉瘤，所述癌肉瘤包含由癌性组织和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺体组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是领域公认的，并且是指间充质衍生的恶性肿瘤。术语“造血肿瘤性病症”包含涉及造血起源的增生性细胞/肿瘤性细胞的疾病。造血性肿瘤病症可能是由骨髓系、淋巴系或红系或其前体细胞引起的。血液癌为开始于如骨髓等成血组织或者免疫系统细胞的癌症。血液癌的实例包含例如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等。

24、如本文所用，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述提供根据本发明的方法进行治疗的动物、人或非人。在本公开中设想了兽医应用和非兽医应用。人类患者可以是成年人或青少年(例如，18岁以下的人)。除了人类，患者包含但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包含例如非人灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔子)、兔类动物、猪类动物(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛和其它家畜动物、农场动物和动物园动物。

25、如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代至少两个氨基酸中的任意长度的氨基酸的聚合物。

26、如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中可互换使用以指代至少两个核苷酸中的任意长度的核苷酸的聚合物，并且包含但不限于dna、rna、dna/rna杂交体和其修饰。

27、除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于在本发明中使用的方法和材料；也可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。这些材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本文提及的全部出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献均通过引用以其整体并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。

28、从以下详细描述和图看，以及从权利要求看，本发明的其它特征和优点将显而易见。