培养表达C-JUN的细胞的方法与流程

发明领域本公开涉及培养细胞(例如，亚全能(pluripotent)、多能(multipotent)和/或免疫细胞(例如，t细胞和/或nk细胞))的方法，所述细胞已被修饰以例如与未修饰的相应细胞相比表达增加水平的c-jun蛋白。如本文所述，在一些方面，使用本文所述的方法培养的免疫细胞也被修饰为包含编码蛋白质(例如，嵌合结合蛋白)的外源多核苷酸，使得所编码的蛋白质由所述细胞表达。在一些方面，本文所公开的方法促进培养中的低分化细胞(less-differentiated cell)和/或未分化细胞的富集，同时保留它们的效应子活性。在一些方面，本文所提供的培养方法也可帮助增加细胞中的相关蛋白质(例如，c-jun)的表达。使用本文所公开的方法培养的细胞可用于多种细胞疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(car)t细胞疗法、tcr t细胞疗法(包括新抗原定向t细胞疗法)和til疗法。

背景技术：

0、发明背景

1、癌症免疫疗法依赖于利用t细胞(免疫系统针对受感染和患病细胞的主要杀手)来攻击并且杀伤肿瘤细胞。然而，免疫细胞靶向并且杀伤肿瘤细胞的能力因肿瘤微环境中存在的各种免疫反应抑制剂的存在而受到抑制。因此，虽然car t细胞在治疗某些癌症方面已取得各种成功(例如，kymriahtm(司利弗明(tisagenlecleucel)，novartis)和yescartatm(阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)，kite/gilead)已获得fda批准)，但挑战依然存在。例如，car t细胞免疫疗法的成功通常受到接受者体内car t扩增的程度限制，car t扩增通常需要大量细胞输注。此外，已观察到转移的car t细胞的耗竭和持久性丧失，从而导致临床疗效丧失和潜在复发。

2、一种克服t细胞耗竭的方式是选择性地施用具有低分化状态的t细胞。例如，t记忆干细胞(tscm)在施用后在患者中持续的时期比高分化t中央记忆(tcm)或t效应子记忆(tem)细胞更长，并且与高分化细胞相比，tscm对肿瘤大小的影响更显著并且更长。然而，多种过继细胞疗法(act)细胞制剂包含在各种分化状态下的免疫细胞的不明确混合物，它们在根除实体肿瘤方面无效。为了治愈，需要具有增强的自我更新干细胞/效应子特性的t细胞产品。因而，本领域中仍需要从分离的t细胞的混合群体中有效富集低分化和/或幼稚t细胞的方法。

技术实现思路

1、本文提供一种在离体或体外培养期间增加免疫细胞(例如，人类免疫细胞)的干性的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养免疫细胞(例如，人类免疫细胞)，其中所述免疫细胞已被修饰以为如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽。本文还提供一种在离体或体外培养期间增加免疫细胞(例如，人类免疫细胞)的产量的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养免疫细胞(例如，人类免疫细胞)，其中所述免疫细胞已被修饰为如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽。本文还提供一种制备用于免疫疗法的免疫细胞(例如，人类免疫细胞)的群体的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养免疫细胞(例如，人类免疫细胞)，其中所述免疫细胞已被修饰为如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽。本公开还提供一种在离体或体外培养期间增加用于免疫疗法的免疫细胞(例如，人类免疫细胞)的干性、同时增加免疫细胞(例如，人类免疫细胞)的产量的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养免疫细胞(例如，人类免疫细胞)，其中所述免疫细胞已被修饰为如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽。本文提供一种离体或体外扩增干细胞样免疫细胞的群体的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养免疫细胞，其中所述免疫细胞已被修饰为如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽。

2、本文提供一种增加免疫细胞回应抗原刺激而产生的细胞因子的方法，其中所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养免疫细胞，其中所述免疫细胞已被修饰为如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽。

3、在一些方面，所述细胞因子包含il-2。在一些方面，在培养后，如与参考免疫细胞相比，回应抗原刺激而产生的细胞因子增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍或更多。

4、本文提供一种增加免疫细胞回应持久抗原刺激的效应子功能的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养免疫细胞，其中所述免疫细胞已被修饰为如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽。

5、在一些方面，如与参考免疫细胞相比，所述免疫细胞在至少一轮、至少两轮或至少三轮额外的抗原刺激分析中保留效应子功能。在一些方面，效应子功能包含以下能力：(i)杀伤靶标细胞(例如，肿瘤细胞)，(ii)在进一步抗原刺激后产生细胞因子，或(iii)(i)和(ii)两者。在一些方面，所述细胞因子包含ifn-γ。

6、在一些方面，在培养后，如与参考免疫细胞相比，所述免疫细胞回应持久抗原刺激的效应子功能增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍或更多。

7、在任何上述方法中，在一些方面，参考免疫细胞包含以下相应免疫细胞：(i)已被修饰以具有增加水平的c-jun多肽并且在不包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养；(ii)未修饰为具有增加水平的c-jun多肽并且在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养；(iii)未修饰为具有增加水平的c-jun多肽并且在不包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养；或(iv)(i)至(iii)的任何组合。

8、在一些方面，所述免疫细胞已被编码c-jun多肽的外源多核苷酸修饰，使得在修饰后，如与未修饰的相应免疫细胞相比，所述免疫细胞具有增加水平的c-jun多肽。

9、在一些方面，c-jun多肽对于免疫细胞是内源性的，并且其中所述免疫细胞已被能够增加内源c-jun多肽的表达的转录激活因子修饰。在一些方面，转录激活因子连接至已被修饰以缺乏核酸内切酶活性的cas蛋白。

10、本文还提供一种增加c-jun多肽在免疫细胞中的表达的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中用编码所述c-jun多肽的外源多核苷酸修饰所述免疫细胞，其中在所述修饰后，与参考细胞相比，所述c-jun多肽在所述免疫细胞中的表达增加。如本文所述，在一些方面，所述参考细胞包含以下相应免疫细胞：(i)已被修饰以具有增加水平的所述c-jun多肽并且在不包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养；(ii)未修饰为具有增加水平的所述c-jun多肽并且在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养；(iii)未修饰为具有增加水平的所述c-jun多肽并且在不包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中培养；或(iv)(i)至(iii)的任何组合。

11、在一些方面，与所述参考细胞相比，所述c-jun多肽的表达增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍或更多。

12、本文提供一种离体或体外制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中用编码c-jun多肽的外源多核苷酸修饰免疫细胞。

13、本文提供一种离体或体外制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法，所述方法包括在包含浓度高于5mm的钾离子的培养基中用能够增加所述内源c-jun多肽的表达的转录激活因子修饰免疫细胞。在一些方面，转录激活因子连接至cas蛋白，所述cas蛋白已被修饰以缺乏核酸内切酶活性。

14、在任何上述方法中，在一些方面，与未修饰的相应免疫细胞相比，c-jun多肽在免疫细胞中过表达。

15、在一些方面，c-jun多肽包含与如seq id no:13中所述的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。

16、在一些方面，编码c-jun多肽的外源多核苷酸包含：a)与如seq id no:1中所述的核酸序列具有至少89％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列；b)与如seq id no:2中所述的核酸序列具有至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列；c)与如seq id no:4中所述的核酸序列具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列；d)与如seq id no:5中所述的核酸序列具有至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列；e)与如seq id no:6中所述的核酸序列具有至少88％、至少89％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列；f)与如seq id no:7中所述的核酸序列具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列；g)与如seq id no:8中所述的核酸序列具有至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列；h)与如seq idno:9中所述的核酸序列具有至少55％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列；或i)与如seq id no:10中所述的核酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的核苷酸序列。

17、在一些方面，编码c-jun多肽的外源多核苷酸包含与如seq id no:1中所述的核酸序列具有至少89％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:1中所述的核酸序列。

18、在一些方面，所述外源多核苷酸包含与如seq id no:2中所述的核酸序列具有至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:2中所述的核酸序列。

19、在一些方面，所述外源多核苷酸包含与如seq id no:4中所述的核酸序列具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:4中所述的核酸序列。

20、在一些方面，所述外源多核苷酸包含与如seq id no:5中所述的核酸序列具有至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:5中所述的核酸序列。

21、在一些方面，所述外源多核苷酸包含与如seq id no:6中所述的核酸序列具有至少88％、至少89％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:6中所述的核酸序列。

22、在一些方面，所述外源多核苷酸包含与如seq id no:7中所述的核酸序列具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:7中所述的核酸序列。

23、在一些方面，所述外源多核苷酸包含与如seq id no:8中所述的核酸序列具有至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:8中所述的核酸序列。

24、在一些方面，所述外源多核苷酸包含与如seq id no:9中所述的核酸序列具有至少55％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:9中所述的核酸序列。

25、在一些方面，所述外源多核苷酸包含与如seq id no:10中所述的核酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述核苷酸序列包含如seq id no:10中所述的核酸序列。

26、在一些方面，上文所提供的方法的免疫细胞还包含编码配体结合蛋白的核苷酸序列。在一些方面，所述配体结合蛋白选自嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)、嵌合抗体-t细胞受体(catcr)、嵌合信号传导受体(csr)、t细胞受体模拟物(tcr模拟物)或它们的组合。在一些方面，car被设计为标准car、分裂car、断开car、接通car、第一代car、第二代car、第三代car或第四代car。在一些方面，所述配体结合蛋白包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域、细胞内信号传导结构域或它们的组合。

27、在一些方面，所述配体结合蛋白的抗原结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：afp(甲胎蛋白)、αvβ6或另一整合素、bcma、braf、b7-h3、b7-h6、ca9(碳酸酐酶9)、ccl-1(c-c模体趋化因子配体1)、cd5、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd45、cd47、cd56、cd66e、cd70、cd74、cd79a、cd79b、cd98、cd123、cd138、cd171、cd352、cea(癌胚抗原)、claudin 18.2、claudin 6、c-met、dll3(δ样蛋白3)、dll4、enpp3(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3)、epcam、epg-2(上皮糖蛋白2)、epg-40、ephrinb2、epha2(肾上腺素受体a2)、erbb二聚体、雌激素受体、etbr(内皮素b受体)、fap-α(纤维母细胞激活蛋白α)、胎儿achr(胎儿乙酰胆碱受体)、fbp(叶酸结合蛋白)、fcrl5、fr-α(叶酸受体α)、gcc(鸟苷酸环化酶c)、gd2、gd3、gpc2(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2)、gpc3、gp100(糖蛋白100)、gpnmb(糖蛋白nmb)、gprc5d(g蛋白偶合受体5d)、her2、her3、her4、乙型肝炎表面抗原、hla-a1(人类白细胞抗原al)、hla-a2(人类白细胞抗原a2)、hmw-maa(人类高分子量黑色素瘤相关抗原)、igf1r(胰岛素样生长因子1受体)、igκ、igλ、il-22ra(il-22受体α)、il-13ra2(il-13受体α2)、kdr(激酶插入结构域受体)、li细胞粘附分子(li-cam)、liv-1、lrrc8a(含富含亮氨酸重复序列的8家族成员a)、lewis y、黑色素瘤相关抗原(mage)-a1、mage-a3、mage-a6、mart-1(melan a)、鼠科动物巨细胞病毒(mcmv)、mcsp(黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、间皮素、粘蛋白1(muc1)、muc16、mhc/肽复合物(例如，与源自afp、kras、ny-eso、mage-a和wt1的肽复合的hla-a)、ncam(神经细胞粘附分子)、nectin-4、nkg2d(自然杀伤2组成员d)配体、ny-eso、胎瘤抗原、pd-1、pd-l1、prame(优先表达的黑色素瘤抗原)、黄体酮受体、psa(前列腺特异性抗原)、psca(前列腺干细胞抗原)、psma(前列腺特异性膜抗原)、ror1、ror2、sirpα(信号调节蛋白α)、slit、slitrk6(ntrk样蛋白6)、steap1(前列腺六跨膜上皮抗原1)、生存素(survivin)、tag72(肿瘤相关糖蛋白72)、tpbg(滋养层糖蛋白)、trop-2、vegfr1(血管内皮生长因子受体1)、vegfr2以及来自hiv、hbv、hcv、hpv和其他病原体的抗原以及它们的任何组合。在一些方面，抗原结合结构域特异性结合ror1。在一些方面，抗原结合结构域特异性结合gpc2。

28、在一些方面，所述配体结合结构域的共刺激结构域包含以下的共刺激结构域：白细胞介素-2受体(il-2r)、白细胞介素-12受体(il-12r)、il-7、il-21、il-23、il-15、cd2、cd3、cd4、cd7、cd8、cd27、cd28、cd30、cd40、4-1bb/cd137、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、light、nkg2c、ox40、dap10或它们的任何组合。在一些方面，共刺激结构域包含4-1bb/cd137共刺激结构域。

29、在一些方面，所述配体结合结构域的跨膜结构域包含以下的跨膜结构域：kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd11a、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkg2d、nkg2c、cd19、cd8或它们的任何组合。在一些方面，跨膜结构域包含cd28跨膜结构域。

30、在一些方面，配体结合结构域的细胞内信号传导结构域包含源自以下的细胞内信号传导结构域：cd3ζ、fcrγ、通用fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd22、cd79a、cd79b、cd278(还称作icos)、fcεri、cd66d、cd32、dap10、dap12或它们的任何组合。在一些方面，细胞内信号传导结构域包含cd3ζ细胞内信号传导结构域。

31、在一些方面，所述配体结合结构域是tcr，其中所述tcr特异性结合肿瘤抗原/mhc复合物。在一些方面，所述肿瘤抗原源自afp、cd19、bcma、cll-1、cs1、cd38、cd19、tshr、cd123、cd22、cd30、cd171、cd33、egfrviii、gd2、gd3、tn ag、psma、ror1、ror2、gpc1、gpc2、flt3、fap、tag72、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-1rα、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、cd20、叶酸受体α、erbb2(her2/neu)、kras、braf、muc1、muc16、egfr、ncam、前列腺酶、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、岩藻糖基gm1、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、叶酸受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd179a、alk、聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-1a、mage-a1、豆荚蛋白、hpv、hpv e6,e7、mage al、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素、端粒酶、pcta-1/半乳糖凝集素8、melana/mart1、ras突变体(例如，hras、kras、nras)、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2 ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b1、boris、sart3、pax5、oy-tes1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人类端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5、igll1、cd2、cd3ε、cd4、cd5、cd7、april蛋白的细胞外部分、新抗原或它们的任何组合。

32、在一些方面，所述c-jun多肽通过接头与所述配体结合蛋白连接。在一些方面，所述接头包含可裂解接头。在一些方面，所述接头是p2a接头、t2a接头、f2a接头、e2a接头、弗林蛋白酶裂解位点或它们的任何组合。在一些方面，所述接头包含与如seq id no:14中所述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述接头包含如seq id no:14中所述的氨基酸序列。

33、在一些方面，上文所提供的任何方法的免疫细胞还包含编码截短的egfr(egfrt)的核苷酸序列，所述egfrt在所述免疫细胞中表达。在一些方面，所述egfrt包含与如seq idno:24中所述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述egfrt包含如seq id no:24中所述的氨基酸序列。

34、在一些方面，egfrt通过接头连接至c-jun多肽和/或配体结合蛋白。在一些方面，所述接头包含可裂解接头。在一些方面，所述接头是p2a接头、t2a接头、f2a接头、e2a接头、弗林蛋白酶裂解位点或它们的任何组合。在一些方面，所述接头包含与seq id no:14中所述的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，接头包含seq idno:14中所述的氨基酸序列。

35、在一些方面，上文所提供的方法的外源多核苷酸包含调节元件，并且其中载体包含外源多核苷酸。在一些方面，载体是多顺反子表达载体。在一些方面，载体包含病毒载体、哺乳动物载体或细菌载体。在一些方面，载体包含腺病毒载体、慢病毒、仙台病毒载体、杆状病毒载体、epstein barr病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杂合载体或腺相关病毒(aav)载体。在一些方面，载体是慢病毒。

36、在一些方面，调节元件包含启动子。在一些方面，启动子包含dl587rev引物结合位点取代(mnd)启动子、ef1a启动子、泛素启动子或它们的组合。

37、在上文所提供的任何方法中，在一些方面，钾离子的浓度高于约10mm、高于约15mm、高于约20mm、高于约25mm、高于约30mm、高于约35mm、高于约40mm、高于约45mm、高于约50mm、高于约55mm、高于约60mm、高于约65mm、高于约70mm、高于约75mm、高于约80mm、高于约85mm或高于约90mm。在一些方面，钾离子的浓度选自由约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm和约80mm组成的组。在一些方面，钾离子的浓度是在约30mm与约80mm之间、约40mm与约80mm之间、约50mm与80mm之间、约60mm与约80mm之间、约70mm与约80mm之间、约40mm与约70mm之间、约50mm与约70mm之间、约60mm与约70mm之间、约40mm与约60mm之间、约50mm与约60mm之间或约40mm与约50mm之间。在一些方面，钾离子的浓度是约50mm、约60mm或约70mm。

38、在一些方面，所述培养基还包含钠离子。在一些方面，所述培养基还包含nacl。在一些方面，所述培养基包含小于约140mm、小于约130mm、小于约120mm、小于约110mm、小于约100mm、小于约90mm、小于约80mm、小于约70mm、小于约60mm、小于约50mm或小于约40mmnacl。

39、在一些方面，所述培养基是低渗或等渗的。在一些方面，所述培养基是低渗的，并且其中钾离子浓度和钠离子浓度的总和乘以2是小于280mm。在一些方面，所述培养基是低渗的，并且其中钾离子浓度和钠离子浓度的总和乘以2是大于240mm并且小于280mm。在一些方面，所述培养基是等渗的，并且其中钾离子浓度和钠离子浓度的总和乘以2是大于或等于280mm并且小于300mm。

40、在一些方面，钾离子的浓度是约60mm，并且nacl的浓度是小于约80mm、小于约75mm、小于约70mm、小于约65mm或小于约60mm。在一些方面，钾离子的浓度是约55mm，并且nacl的浓度是小于约85mm、小于约80mm、小于约75mm、小于约70mm或小于约65mm。在一些方面，钾离子的浓度是约50mm，并且nacl的浓度是小于约90mm、小于约85mm、小于约80mm、小于约75mm或小于约70mm。

41、在一些方面，上文所提供的方法的培养基还包含一种或多种细胞因子。在一些方面，所述一种或多种细胞因子包含白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-7(il-7)、白细胞介素-21(il-21)、白细胞介素-15(il-15)或它们的任何组合。在一些方面，所述一种或多种细胞因子包含il-2、il-7和il-15。

42、在一些方面，所述培养基包含浓度为约50iu/ml至约500iu/ml的il-2。在一些方面，il-2的浓度是约50iu/ml、约60iu/ml、约70iu/ml、约80iu/ml、约90iu/ml、约100iu/ml、约125iu/ml、约150iu/ml、约175iu/ml、约200iu/ml、约225iu/ml、约250iu/ml、约275iu/ml、约300iu/ml、约350iu/ml、约400iu/ml、约450iu/ml或约500iu/ml。在一些方面，il-2的浓度是在约100iu/ml至约300iu/ml之间。在一些方面，il-2的浓度是约200iu/ml。

43、在一些方面，所述培养基包含浓度为约50iu/ml至约500iu/ml的il-21。在一些方面，il-21的浓度是约50iu/ml、约60iu/ml、约70iu/ml、约80iu/ml、约90iu/ml、约100iu/ml、约125iu/ml、约150iu/ml、约175iu/ml、约200iu/ml、约225iu/ml、约250iu/ml、约275iu/ml、约300iu/ml、约350iu/ml、约400iu/ml、约450iu/ml或约500iu/ml。在一些方面，il-21的浓度是在约100iu/ml至约300iu/ml之间。在一些方面，il-21的浓度是约200iu/ml。

44、在一些方面，所述培养基包含浓度为约500iu/ml至约1,500iu/ml的il-7。在一些方面，il-7的浓度是约500iu/ml、约550iu/ml、约600iu/ml、约650iu/ml、约700iu/ml、约750iu/ml、约800iu/ml、约850iu/ml、约900iu/ml、约950iu/ml、约1,000iu/ml、约1,050iu/ml、约1,100iu/ml、约1,150iu/ml、约1,200iu/ml、约1,250iu/ml、约1,300iu/ml、约1,350iu/ml、约1,400iu/ml、约1,450iu/ml或约1,500iu/ml。在一些方面，il-7的浓度是约1,000iu/ml至约1,400iu/ml。在一些方面，il-7的浓度是约1,200iu/ml。

45、在一些方面，所述培养基包含浓度为约50iu/ml至约500iu/ml的il-15。在一些方面，il-15的浓度是约50iu/ml、约60iu/ml、约70iu/ml、约80iu/ml、约90iu/ml、约100iu/ml、约125iu/ml、约150iu/ml、约175iu/ml、约200iu/ml、约225iu/ml、约250iu/ml、约275iu/ml、约300iu/ml、约350iu/ml、约400iu/ml、约450iu/ml或约500iu/ml。在一些方面，il-15的浓度是在约100iu/ml至约300iu/ml之间。在一些方面，il-15的浓度是约200iu/ml。

46、在一些方面，所述培养基还包含细胞扩增剂。在一些方面，所述细胞扩增剂包含gsk3b抑制剂、acly抑制剂、pi3k抑制剂、akt抑制剂或它们的任何组合。在一些方面，pi3k抑制剂选自羟基柠檬酸盐、ly294002、匹替利司(pictilisib)、cal101、ic87114和它们的任何组合。在一些方面，akt抑制剂选自mk2206、a443654、akti-viii和它们的任何组合。

47、在一些方面，如与开始免疫细胞相比，与在不含高浓度的钾离子的培养基中培养的免疫细胞和/或不含c-jun多肽的免疫细胞相比，上文所提供的方法的培养基能够在最终细胞产物中：a)增加低分化和/或未分化细胞的数目和/或百分率；b)增加转导效率；c)增加干细胞样免疫细胞；d)增加体内活力；e)增加细胞效能；f)防止细胞耗竭；或g)它们的任何组合。

48、在一些方面，所述培养基还包含钙离子、葡萄糖或它们的任何组合。

49、在一些方面，所述培养基还包含葡萄糖，并且其中葡萄糖的浓度是大于约10mm。在一些方面，葡萄糖的浓度是约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约15mm至约25mm、约15mm至约20mm、约15mm至约19mm、约15mm至约18mm、约15mm至约17mm、约15mm至约16mm、约16mm至约20mm、约16mm至约19mm、约16mm至约18mm、约16mm至约17mm、约17mm至约20mm、约17mm至约19mm或约17mm至约18mm。在一些方面，葡萄糖的浓度是约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm或约25mm。在一些方面，葡萄糖的浓度是约15.4mm、约15.9mm、约16.3mm、约16.8mm、约17.2mm或约17.7mm。

50、在一些方面，所述培养基还包含钙离子，并且其中钙离子的浓度是大于约0.4mm。在一些方面，钙离子的浓度是约0.4mm至约2.8mm、约0.4mm至约2.5mm、约0.5mm至约2.0mm、约1.0mm至约2.0mm、约1.1mm至约2.0mm、约1.2mm至约2.0mm、约1.3mm至约2.0mm、约1.4mm至约2.0mm、约1.5mm至约2.0mm、约1.6mm至约2.0mm、约1.6mm至约2.8mm、约1.7mm至约2.0mm、约1.8mm至约2.0mm、约1.2至约1.3mm、约1.2至约1.4mm、约1.2至约1.5mm、约1.2至约1.6mm、约1.2至约1.7mm、约1.2至约1.8mm、约1.3至约1.4mm、约1.3至约1.5mm、约1.3至约1.6mm、约1.3至约1.7mm、约1.3至约1.8mm、约1.4至约1.5mm、约1.4至约1.6mm、约1.4至约1.7mm、约1.4至约1.8mm、约1.5至约1.6mm、约1.5至约1.7mm、约1.5至约1.8mm、约1.6至约1.7mm、约1.6至约1.8mm或约1.7至约1.8mm。在一些方面，钙离子的浓度是约1.0mm、约1.1mm、约1.2mm、约1.3mm、约1.4mm、约1.5mm、约1.6mm、约1.7mm、约1.8mm、约1.9mm、约2.0mm、约2.1mm、约2.2.mm、约2.3mm、约2.4mm、约2.5mm、约2.6mm、约2.7mm、约2.8mm、约2.9mm或约3.0mm。

51、在一些方面，所述免疫细胞在培养后为cd3+、cd45ro-、ccr7+、cd45ra+、cd62l+、cd27+、cd28+或tcf7+，或它们的任何组合。

52、本文提供一种人类免疫细胞群体，所述人类免疫细胞群体通过本文所提供的任何方法加以制备。在一些方面，所述免疫细胞为t细胞。在一些方面，t细胞包含cd8+t细胞、cd4+t细胞或两者。

53、本文提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的人类免疫细胞群体。

54、本文提供一种组合物，所述组合物包含cd4+t细胞和cd8+t细胞群体，所述t细胞已被修饰以(a)表达嵌合抗原受体(car)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-jun多肽，其中(i)至少约20％的所述修饰的cd4+t细胞对ccr7和cd45ra呈表面阳性；(ii)至少约20％的所述修饰的cd8+t细胞对ccr7和cd45ra呈表面阳性；或(iii)(i)和(ii)两者。本文提供一种组合物，所述组合物包含cd4+t细胞群体，所述t细胞已被修饰以(a)表达嵌合抗原受体(car)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-jun多肽，其中至少约20％的所述修饰的cd4+t细胞对ccr7和cd45ra呈表面阳性。本文提供一种组合物，所述组合物包含cd8+t细胞群体，所述t细胞已被修饰以(a)表达嵌合抗原受体(car)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-jun多肽，其中至少约20％的所述修饰的cd8+t细胞对ccr7和cd45ra呈表面阳性。

55、本文提供一种组合物，所述组合物包含cd4+t细胞和cd8+t细胞群体，所述t细胞已被修饰以(a)表达工程改造的t细胞受体(tcr)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-jun多肽，其中(i)至少约15％的所述修饰的cd4+t细胞对ccr7和cd45ra呈表面阳性；(ii)至少约20％的所述修饰的cd8+t细胞对ccr7和cd45ra呈表面阳性；或(iii)(i)和(ii)两者。本文提供一种组合物，所述组合物包含cd4+t细胞群体，所述t细胞已被修饰以(a)表达工程改造的t细胞受体(tcr)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-jun多肽，其中至少约15％的所述修饰的cd4+t细胞对ccr7和cd45ra呈表面阳性。本文提供一种组合物，所述组合物包含cd8+t细胞群体，所述t细胞已被修饰以(a)表达工程改造的t细胞受体(tcr)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的所述c-jun多肽，其中至少约20％的所述修饰的cd8+t细胞对ccr7和cd45ra呈表面阳性。

56、本文还提供一种组合物，所述组合物包含免疫细胞群体，所述免疫细胞已被修饰以(a)表达工程改造的嵌合抗原受体(car)或工程改造的t细胞受体(tcr)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽，其中至少约4％的细胞是祖细胞耗竭t细胞。本公开的一些方面涉及一种组合物，所述组合物包含免疫细胞群体，所述免疫细胞已被修饰以(a)表达工程改造的嵌合抗原受体(car)或工程改造的t细胞受体(tcr)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽，其中约4％与约6％之间的细胞是祖细胞耗竭t细胞。本文还提供一种组合物，所述组合物包含免疫细胞群体，所述免疫细胞已被修饰以(a)表达工程改造的嵌合抗原受体(car)或工程改造的t细胞受体(tcr)并且(b)如与未修饰为具有增加水平的c-jun多肽的相应免疫细胞相比，具有增加水平的c-jun多肽，其中至少约4％的细胞是祖细胞耗竭t细胞并且至少约4％的细胞是干细胞样t细胞。

57、在一些方面，本文所述的人类免疫细胞群体、药物组合物或组合物是用于治疗需要疗法的受试者。本文还提供本文所述的人类免疫细胞群体、药物组合物或组合物的用途，用于制造用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或疾患的药剂。在一些方面，所述疾病或疾患包含癌症。

58、本文提供本文所述的人类免疫细胞群体、药物组合物或组合物的用途，用于防止或减少可用于疗法的细胞的耗竭。

59、本文提供一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括施用本文所述的人类细胞群体、药物组合物或组合物中的任一者。在一些方面，所述疾病或疾患包含癌症。