用于有效体内递送的组合物和方法与流程

背景技术：

1、逆转录病毒可以成为病毒样颗粒(vlp)的有吸引力的支架。逆转录病毒衣壳通常缺乏许多无包膜二十面体病毒的严格对称性要求(zhang等人,2015)，这表明其提高的结构灵活性，以掺入非天然蛋白质货物。此外，逆转录病毒嗜性可以通过用不同的包膜糖蛋白对病毒体进行假型化来调节，这可以使得vlp能够靶向至特定的细胞类型(cronin等人,2005)。先前的工作研究证明，将期望的蛋白质货物融合至逆转录病毒gag多聚蛋白的c端，足以指导该货物蛋白质在逆转录病毒颗粒之内的包装(kaczmarczyk等人.,2011；voelkel等人,2010)。最近，已经将相似的策略应用于将cas9 rnp包装在逆转录病毒颗粒内(mangeot等人,2019)。然而，仍然需要具有治疗性水平的体内递送效率的vlp。

技术实现思路

0、发明概述

1、在一方面，本发明提供了含脂质颗粒，其包含(a)人内源性逆转录病毒(herv)包膜蛋白、人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性细胞融合分子；(b)包含与核输出序列(nes)偶联的质膜定位蛋白的融合蛋白；以及(c)治疗性货物。

2、在另一方面，本发明提供了组合物，其包含(a)编码人内源逆转录病毒(herv)包膜蛋白、人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性细胞融合分子的第一核酸分子；(b)编码融合蛋白的第二核酸分子，所述融合蛋白包含与核输出序列(nes)偶联的质膜定位蛋白和货物，其中该货物包含治疗性货物或治疗性货物的结合配偶体。在另一方面，本公开提供了编码融合蛋白的核酸分子，该融合蛋白包含与核输出序列(nes)偶联的质膜定位蛋白和货物，其中该货物包含治疗性货物或治疗性货物的结合配偶体。

3、在另一方面，本说明书描述了含脂质颗粒，其包含(a)人内源性逆转录病毒(herv)包膜蛋白，(b)人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性细胞融合分子；(c)融合蛋白，其包含与可切割接头偶联的质膜定位蛋白；以及(d)治疗性货物。在一些实施方案中，融合蛋白包含nes。

4、在另一方面，本公开提供了生产本文所述的含脂质颗粒的方法，其包括以下步骤：(a)提供系统，该系统表达(i)人内源性逆转录病毒(herv)包膜蛋白、人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性细胞融合分子；(ii)包含与核输出序列(nes)偶联的质膜定位蛋白的融合蛋白；和(iii)货物，其中该系统生成含脂质颗粒；以及任选地(b)收获并纯化含脂质颗粒。

5、在进一步的方面，本公开描述了生产本文所述的含脂质颗粒的方法，其包括：(a)提供系统，该系统表达(i)人内源性逆转录病毒(herv)包膜蛋白、人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性细胞融合分子；(ii)包含与可切割接头偶联的质膜定位蛋白的融合蛋白；和(iii)货物，其中该系统生成含脂质颗粒；以及任选地(b)收获并纯化含脂质颗粒。在一些实施方案中，融合蛋白包含nes。

6、在另一方面，本公开提供了生产本文所述的含脂质颗粒的方法，其包括(a)提供表达融合蛋白的系统，该融合蛋白包含(i)人源化逆转录病毒结构蛋白；人内源性逆转录病毒(herv)结构蛋白，任选地herv gag；普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(ph)结构域；或非免疫原性质膜募集蛋白；和(ii)核输出序列(nes)，其中该系统产生含脂质颗粒；以及任选地(b)收获并纯化含脂质颗粒。

7、在又一方面，本公开提供了产生本文所述的含脂质颗粒的方法，其包括(a)提供表达融合蛋白的系统，该融合蛋白包含(i)人源化逆转录病毒结构蛋白；人内源性逆转录病毒(herv)结构蛋白，任选地herv gag；普列克底物蛋白同源(ph)结构域；或非免疫原性质膜募集蛋白，(ii)可切割接头，和(iii)货物；其中该系统产生含脂质颗粒；以及任选地(b)收获并纯化含脂质颗粒。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含nes。

8、在各个实施方案中，质膜定位蛋白包含人内源性逆转录病毒(herv)结构蛋白，任选地herv gag；人源化病毒结构蛋白；普列克底物蛋白同源(ph)结构域；或非免疫原性质膜募集蛋白。

9、在各个实施方案中，治疗性货物可以包含核酸酶、碱基编辑器、先导编辑器(primeeditor)、表观遗传编辑器、限制性核酸内切酶(任选地iis型限制性酶)、重组酶、转录因子、抗体、嵌合抗原受体、t细胞受体、细胞器、核酸分子、dna、rna、逆转录转座子、逆转录酶、寡核苷酸、适体酶、适体、核酶、小分子化合物或其任何组合。在一些实施方案中，治疗性货物不包含核酸酶、逆转录酶、碱基编辑器或先导编辑器。在一些实施方案中，治疗性货物是蛋白质(例如，核酸酶、碱基编辑器、先导编辑器、表观遗传编辑器、限制性核酸内切酶(任选地iis型限制性酶)、重组酶、转录因子、抗体、嵌合抗原受体、t细胞受体或逆转录酶)。在一些实施方案中，治疗性货物是核酸分子(例如，dna、rna、逆转录转座子、适体酶、适体或核酶)。在一些实施方案中，治疗性货物是表观遗传编辑器、限制性核酸内切酶(任选地iis型限制性酶)、重组酶、转录因子、抗体、嵌合抗原受体、t细胞受体、细胞器、核酸分子、dna、rna、逆转录转座子、寡核苷酸、适体酶、适体、核酶、小分子化合物或其任何组合。

10、在各个实施方案中，融合蛋白可以包含按从n端到c端顺序排列的质膜定位蛋白、nes和治疗性货物。融合蛋白还可以包含可切割接头，任选地其中可切割接头位于质膜定位蛋白和治疗性货物之间，任选地其中可切割接头位于nes和治疗性货物之间，任选其中融合蛋白进一步包含位于可切割接头c端的核定位序列(nls)。在一些实施方案中，nls位于融合蛋白之内，使得其在可切割接头切割后仍附接至治疗性货物，从而允许将治疗性货物递送至细胞核。

11、在各个实施方案中，质膜定位蛋白可以是人内源性逆转录病毒(herv)结构蛋白，任选地herv gag；人源化病毒结构蛋白；普列克底物蛋白同源(ph)结构域；或非免疫原性质膜募集蛋白。

12、在各个实施方案中，治疗性货物是核酸酶、碱基编辑器、先导编辑器、表观遗传编辑器、限制性核酸内切酶(任选地iis型限制性酶)、重组酶、转录因子、抗体、嵌合抗原受体、t细胞受体、细胞器、核酸分子、dna、rna、逆转录转座子、逆转录酶、寡核苷酸、适体酶、适体、核酶或小分子化合物或其任何组合。

13、在另一方面，本公开提供了含脂质颗粒，其包含封装蛋白核心的脂质膜，其中该蛋白核心包含组特异性抗原(gag)蛋白酶(pro)多聚蛋白和切割产物，其中该含脂质颗粒进一步包含治疗性货物，其中治疗性货物存在于蛋白核心内部，并且其中切割产物包含(i)gag核衣壳蛋白的序列和(ii)核输出序列(nes)，并且缺乏治疗性货物。在一些实施方案中，治疗性货物与核定位序列(nls)融合。

14、另一方面，本发明提供了含脂质颗粒，其包含包封蛋白核心的脂质膜，其中该蛋白核心包含组特异性抗原(gag)蛋白酶(pro)多聚蛋白和融合蛋白，其中该融合蛋白包含gag核衣壳蛋白的序列、治疗性货物、可切割接头和核输出序列(nes)，并且其中可切割接头位于治疗性货物和nes之间。

15、在另一方面，本公开提供了含脂质颗粒的群体，其中该群体包含含脂质颗粒，该含脂质颗粒包含封装蛋白核心的脂质膜，其中该蛋白核心包含组特异性抗原(gag)蛋白酶(pro)多聚蛋白和融合蛋白，其中该群体包含含有治疗性货物的含脂质颗粒，其中治疗性货物存在于蛋白核心内部，其中在含脂质颗粒的群体中，存在于蛋白核心内部的治疗性货物的量与融合蛋白的量的比率是至少1.5，其中融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，并且其中第一多肽包含gag核衣壳蛋白的序列，并且第二多肽包含治疗性货物的序列。

16、在另一方面，本发明提供了组合物，其包含(i)第一多核苷酸，其包含编码组特异性抗原(gag)蛋白酶(pro)多聚蛋白的核酸序列；(ii)第二多核苷酸，其包含编码融合蛋白的核酸序列，其中该融合蛋白包含：gag核衣壳蛋白的序列、治疗性货物、可切割接头和核输出序列(nes)，并且其中该可切割接头位于治疗性货物和nes之间。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。

17、在另一方面，本公开提供了融合蛋白，其包含gag核衣壳蛋白的序列、治疗性货物、可切割接头和核输出序列(nes)；其中可切割接头位于治疗性货物和nes之间。

18、另一方面，本公开提供了在例如核酸编辑方法中使用本文提供的含脂质颗粒的方法。

19、在另一方面，本公开提供了用于产生本文提供的含脂质颗粒的细胞。在一些实施方案中，细胞包含编码本文提供的含脂质颗粒的组分的任何核酸。

20、在另一方面，本公开提供了包含本文提供的任何含脂质纳米颗粒、核酸序列、融合蛋白和组合物的试剂盒。

21、应当理解，上述构思以及下文讨论的额外的构思可以以任何合适的组合排列，因为本公开在这方面不受限制。此外，当与所附的图结合来进行考虑时，从以下对各个非限制性实施方案的详细描述中，本公开的其它优点和新颖的特征将变得显而易见。

22、援引并入

23、本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指示通过引用并入一样。