一种促进花青苷合成的PyMYB73基因及其重组表达载体与应用

本发明属于植物基因工程领域，涉及促进花青苷合成的pymyb73基因及其重组表达载体的构建与应用，具体涉及从梨中分离、克隆得到一个参与梨果皮花青苷生物合成相关的pymyb73基因及其应用。

背景技术：

1、梨(pyrus l.)是世界上最常见和最受欢迎的水果之一，红皮梨因其鲜艳的颜色和丰富的营养价值而被世界各地的消费者广泛接受(tao et al.，2018)。梨皮的红色是由于花青素的积累(zhang et al.，2020)，花青素主要在植物中合成，提供各种颜色，并由于成分和细胞活动的复杂环境而受到保护。此外，花青素具有显著的抗氧化活性和对人体健康的潜在益处，如降低癌症、冠状动脉粥样硬化和炎症的风险(butelli et al.，2008；sun etal.，2014)。

2、众所周知，花青素的生物合成受到关键结构基因和转录因子的调控，包括一系列酶的催化，比如苯丙氨酸解氨酶(pal)，查尔酮合成酶(chs)，查尔酮异构酶(chi)，黄烷酮-3-羟化酶(f3h)，二氢黄酮醇-4-还原酶(dfr)，花色素合成酶/无色花青素双加氧酶(ans/ldox)，udp-葡萄糖：类黄酮3-o-葡糖基转移酶(ufgt)。此外，生物合成的花青素被转运到液泡储存器中依赖于已经报道了的花青素转运的三种机制：谷胱甘肽s-转移酶(gst)介导的转运，膜转运和囊泡运输(gomez et al.，2011；zhao et al.，2009)。研究发现，gst可以将花青苷与谷胱甘肽结合在一起并形成稳定络合物，随后通过abc跨膜转运蛋白将稳定的花青苷从细胞质中转移到液泡膜中(marrs et al.，1995)。yang等人发现，与‘红茄’梨的绿色芽变品种比较，gst基因在‘红茄’梨品种中表现出较高的转录水平(2015)。cheng等人报道了通过插入突变后的编码gst的基因，导致桃花花瓣出现斑斓的颜色(2015)。

3、通过形成mbw转录复合物，myb，bhlh和wd40蛋白可以调节结构基因(holtonetal.，1995)。mybs根据含有相邻的myb重复序列(r)的数量，可分为四种类型。其中，r2r3-myb转录因子是植物界最常见的一类，其具有保守的n端myb结合域和可变的c端部分，c端通常存在激活或抑制结构域(stracke et al.，2001；dubos et al.，2010)。在梨果实中已经鉴定出231个myb家族成员，其中含有185个典型的r2r3-myb蛋白。大部分myb转录因子在梨果实中的功能尚不清楚，但有少数myb转录因子被报导参与调节梨果实中的黄酮、原花青苷和花青苷的积累(albert et al.，2014；kagale et al.，2011；kranz et al.，1998；wei etal.，2018)。例如pymyb114被报道与pybhlh3、pyerf3之间相互作用形成调控复合体，促进梨果实花青素的积累(yao et al.，2017)；pymyb9是一种tt2型myb转录因子，不仅通过结合pyanr的启动子促进原花青素的积累，而且通过结合pyufgt1的启动子诱导花青苷和类黄酮的合成(zhai et al.，2016)；pyhy5通过结合到pymyb10上的g-box结合域，激活下游花青苷生物合成相关基因的表达(wang et al.，2020)。在其他物种中，lin等人发现了mdmyba或mdmyb1可以与mdmyb10相互作用，从而促进了苹果花青素的生物合成(lin-wang et al.，2010)。除此之外，拟南芥中的atmyb75、atmyb113和atmyb114，葡萄中的vvmyba1/a2，桃中的ppmyb10.1也被报道作为激活剂参与了原花青素、类黄酮或花青素的生物合成(dubos etal.，2010；walker et al.，2007；rahim et al.，2014)。然而，pymyb73是否通过与红梨中的pymyb10，pybhlh3或pymyb114相互作用来参与花青素生物合成尚不清楚，有待进一步研究。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抑制花青苷生物合成的梨转录因子pyerf4.2基因及其重组表达载体与应用。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进花青苷合成的pymyb73基因，所述促进pymyb73基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种由权利要求1所述的促进花青苷合成的pymyb73基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种含有权利要求1所述的促进花青苷合成的pymyb73基因的宿主菌。

5、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种克隆权利要求1所述的促进花青苷合成的pymyb73基因的引物，包括：克隆pymyb73基因的瞬时表达引物对，上游引物pymyb73-f1序列如seq id no.3所示，下游引物pymyb73-r1序列如seq id no.4所示；克隆pymyb73基因稳定表达的引物对，上游引物pymyb73-f2序列如seq id no.5所示，下游引物pymyb73-r2序列如seq id no.6所示。

6、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进花青苷合成的pymyb73基因在促进梨果皮花青苷合成中的应用。

7、优选的技术方案为：促进花青苷合成的pymyb73基因联合pymyb10基因在促进梨果皮中花青苷合成中的应用，所述促进pymyb73基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

8、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种含有促进花青苷合成的pymyb73基因的重组表达载体，其特征在于：促进pymyb73基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

9、优选的技术方案为：以psak277为出发载体，将促进花青苷合成的pymyb73基因插入ecor i和xbal i位点之间所得；或者以pcambia1300为出发载体，将促进花青苷合成的pymyb73基因插入bamh i和sac i位点之间所得。

10、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：含有促进花青苷合成的pymyb73基因的重组表达载体在促进梨果皮中花青苷合成中的应用，其特征在于：促进pymyb73基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

11、优选的技术方案为：含有促进花青苷合成的pymyb73基因的重组表达载体联合含pymyb10基因的重组载体在梨愈伤花青苷合成中的应用。

12、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

13、1.pymyb73基因在促进梨果皮中花青苷合成的应用，为促进梨果皮中花青苷的积累的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

14、2.本发明将转录因子pymyb73与辅助因子pymyb10，pybhlh3或pymyb114共转化草莓果实和早酥梨果皮导致草莓果实和早酥梨果皮花青苷大量积累，表明本发明克隆pymyb73与辅助因子pymyb10，pybhlh3或pymyb114联合促进梨果皮中花青苷合成的功能。此外，本发明得到了pymyb73过表达的梨愈伤组织，并对其进行光照处理，发现pymyb73能够促进梨愈伤组织花青苷的合成。