一种基于ERA技术的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型黄头病毒多重快速检测方法及检测用引物和探针

本发明涉及生物，具体涉及一种基于era技术的基因ⅰ型和基因ⅱ型黄头病毒多重快速检测方法及检测用引物和探针。

背景技术：

1、在过去的几十年中，对虾养殖产业迅速扩大和发展，已经成为海水养殖业中发展最快、最具经济价值的产业之一，但同时也存在诸多问题。当前对虾主要养殖种类包括凡纳滨对虾(penaeus vannamei)、斑节对虾(penaeus monodon)、中国对虾(penaeuschinensis)等，其中，凡纳滨对虾是当今世界水产养殖经济产值最高的种类。随着产业的发展，对虾养殖行业也面临多种致病原的出现，包括细菌、真菌、病毒等。1990年，人们在泰国的黑虎虾中首次发现了黄头病毒(yellow-head virus，yhv)，该病毒引起了黑虎虾的大量死亡。此外，在澳洲再次发现一种病毒—鳃联病毒(gill-associated virus，gav)，此种病毒跟在泰国发现的黄头病毒核酸序列与结构皆极为相似。黄头病毒属(复合群)目前已知的有6个基因型，其中yhv是基因ⅰ型，gav是基因ⅱ型，它们是两种主要致病基因型。黄头病毒是一种单链rna病毒，感染后表现为肝胰腺黄化及全身肌肉白化的临床症状，在感染初期，病虾摄食量先增大然后突然停止，接下来便会发现有大量垂死的虾聚集池塘角落的水面。在形态和病理上，gav与yhv非常相似，因此有必要建立一种黄头病毒快速多重检测的方法，在早期做出感染状态的诊断，能够有效避免产生巨大的经济损失以及用于健康对虾种苗筛选。

2、目前，对虾主要病原的诊断技术包括免疫学检测技术和分子生物学检测技术。酶联免疫技术(elisa)、免疫胶体金技术、免疫荧光抗体技术等具有检测灵敏度较低，制备抗体的步骤繁琐，成本较高且耗时长等不利条件；常规pcr(polymerase chain reaction)、荧光定量pcr(quantitative real-time pcr)、巢式pcr(nest pcr)等技术均在仪器设备、操作步骤等方面限制了其在现场检测的应用。酶促重组等温扩增技术(enzymaticrecombinase amplification，era)是中国苏州先达基因科技有限公司开发出的等温扩增技术，具有快速简便、操作简单、结果可靠的优点。与pcr、lamp相比，era仅在32-45℃30min内即可完成快速检测。目前还没有将era技术应用于快速多重检测凡纳滨对虾中的黄头病毒的报道。

技术实现思路

1、鉴于现有技术的不足，本发明选取黄头病毒属的保守区域orf1b作为检测的靶基因(gen bank登录号：yhv，eu487200.1；gav，af227196.2)，并针对靶基因序列设计了era检测引物和探针(如图1所示)，建立了多重检测黄头病毒的real-time era(rt-era)技术。

2、本发明技术方案主要包括以下内容：

3、一种基于era技术的基因ⅰ型和基因ⅱ型黄头病毒多重快速检测方法，包括以下步骤：

4、(1)以黄头病毒的orf1b区域作为检测靶基因，设计合成用于检测基因ⅰ型黄头病毒的引物yhv2和探针yhv-probe，以及用于检测基因ⅱ型黄头病毒的引物gav1和探针gav-probe或用于检测基因ⅱ型黄头病毒的引物gav2和探针gav-probe；引物yhv2的上游引物序列如seq id no:9所示，下游引物序列如seq id no:10所示；引物gav1的上游引物序列如seq id no:3所示，下游引物序列如seq id no:4所示；引物gav2的上游引物序列如seq idno:13所示，下游引物序列如seq id no:14所示；

5、(2)以待测样品的基因组dna为模板，采用步骤(1)的引物和探针进行era检测，判断检测结果。

6、进一步的，步骤(2)进行基础型era检测，判断检测结果的方法是：若在100-300bp处出现特异性条带，则表明扩增结果为阳性。

7、进一步的，步骤(1)选择的引物是引物yhv2和gav1，步骤(2)进行基础型era检测，判断检测结果的方法是：若在100bp处出现特异性条带，则表明扩增结果为基因ⅱ型黄头病毒阳性；若在300bp处出现特异性条带，则表明扩增结果为基因ⅰ型黄头病毒阳性。

8、进一步的步骤(2)进行荧光型era检测，判断检测结果的方法是：

9、在era扩增的30min内扩增曲线的荧光值出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测样品感染基因ⅰ型或基因ⅱ型黄头病毒，若出现两条扩增曲线，则表明同时待测样品同时感染两种基因ⅰ型和基因ⅱ型黄头病毒；若era扩增产物不满足上述条件，则表明扩增结果为阴性，即待测病毒不是黄头病毒。

10、进一步的era检测程序：32℃-45℃反应30min。

11、进一步的era检测程序：42℃反应30min。

12、本发明涉及用于基因ⅰ型和基因ⅱ型黄头病毒多重快速检测的引物和探针，包括：用于检测基因ⅰ型黄头病毒的引物yhv2和探针yhv-probe，以及用于检测基因ⅱ型黄头病毒的引物gav1和探针gav-probe或用于检测基因ⅱ型黄头病毒的引物gav2和探针gav-probe；引物yhv2的上游引物序列如seq id no:9所示，下游引物序列如seq id no:10所示；引物gav1的上游引物序列如seq id no:3所示，下游引物序列如seq id no:4所示；引物gav2的上游引物序列如seq id no:13所示，下游引物序列如seq id no:14所示。

13、进一步的，探针yhv-probe依序包括seq id no.5所示序列、thf和seq id no.6所示序列，探针gav-probe依序包括seq id no.7所示序列、thf和seq id no.8所示序列；

14、seq id no.5自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了fam荧光报告基团的胸腺嘧啶核苷酸，seq id no.6自5’端起第一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了bhq1荧光猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸；seq id no.7自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了rox荧光报告基团的胸腺嘧啶核苷酸，seq id no.8自5’端起第一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了bhq2荧光猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸；thf为外切酶的切断位点。

15、与现有技术相比，本发明的有益成果在于：

16、本发明的黄头病毒的era引物和探针可以有效扩增靶基因，灵敏度达到102copies/μl(拷贝/μl)，可以达到与nest pcr灵敏性相当的水平，与白斑综合征病毒(wssv)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(ihhnv)、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、肝肠胞虫(ehp)以及健康对虾dna均无交叉反应。本发明的era等温扩增体系在32-45℃下30min以内可实现靶基因的高效扩增。

17、本发明方法可以实现两种基因型黄头病毒的多重检测，并且摆脱了对热循环仪的依赖，实验操作步骤简单，耗时短速度快，检测灵敏度较高。

18、本发明方法不仅可用于感染一种基因型的黄头病毒的现场快速检测，也可用于同时感染多种基因型的黄头病毒检测，为病原体的现场筛查提供了可用的快速检测方法。该方法也可应用到临床检验、海关违禁生物检测、企业质检等领域，为其提供技术支持，具有明显的实际应用价值。