一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法与流程

本发明涉及细胞培养，具体为一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法。

背景技术：

1、细胞培养实验在专注于集音充足人血清蛋白研究的一种主要技术，应用于化妆品级，细胞培养基、保护剂、辅料等注射剂等领域。一个优秀的细胞株能让培养工艺开发工作达到事半功倍的效果，为尽量减短项目的早期研发时间，通常可以使用平台化的工艺进行放大生产。除了放大研究及生产外，如何通过工艺开发，让高表达细胞株的表达水平和产品质量能百尺竿头更进一步，是一项不小的挑战。

2、现有的细胞株培养的开发，大多数都是传统的补料流加入培养，无论是传统的批次补料培养，还是灌流培养，培养基和补料对产品的产量和质量均有举足轻重的营销，从成本角度考虑，细胞增殖效果越好，越能提高产品的质量，现有的培养液的成分非常复杂，主要包含氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物、油脂、激素、生长因子等等，但是不同温度、湿度的培植环境，增殖能力也不同，如何提高细胞增殖，成为细胞培养研究的新方向。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法，具备二次融合加入添加营养液，配合一次和二次的细胞增殖检测，便于细胞增殖过程中，调配营养剂，提高细胞增殖的有益效果，解决了上述背景技术中所提到如何提高细胞增殖，成为细胞培养研究的新方向的问题。

2、本发明提供如下技术方案：一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法，该方法包括以下步骤：

3、步骤一，采集对数生长期的细胞，获得核细胞；

4、步骤二，进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞，按一定的倍数稀释细胞悬液，获得样本a；

5、步骤三，实时采集实验环境数据，设置温度传感器、转速传感器、溶氧传感器和ph传感器，设置预设温度、搅拌转速、溶氧参数、ph参数，进而在这个条件下，按配方调配培养液；

6、步骤四，将培养液和样本a融合，放入培养器皿后，加入氧气融合，调速搅拌，在培养基中加入增殖生长因子，检测细胞增殖情况，获得a1培养溶液；

7、步骤五，按配方调配细胞培养剂，根据不同物质，调配获得j1/j2/j3/j4样品；

8、步骤六，将部分培养基分别和j1/j2/j3/j4进行搅拌、抽真空脱气泡后经冷却放置，获得培养液b1/b2/b3/b4；

9、步骤七，将a1培养液分别和培养液b1/b2/b3/b4进行融合，放入恒温培养箱培养；

10、步骤八，二次进行细胞增殖检测，配合增殖检测数据，进行细胞周期调控。

11、作为本发明所述一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：所述步骤二获得样本a过程需要取对数生长期的细胞，105细胞接种于6孔板或培养皿中，通过离心机进行上下左右转动，使细胞分散均匀。

12、作为本发明所述一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：步骤三中用细胞培养液以1:10000的比例稀释edu溶液，制备适量50μmedu培养基，提取去离子水加至100％比例、0.1％乙二胺四乙酸二钠、0.3％黄原胶，维生素、1.3－丁二醇的材料，加入增殖生长因子合成溶液，每孔加入500μl50μmedu培养基中孵育2h；

13、溶液配置的ph为7.2-7.6；

14、其中，培养液的制备工艺为：

15、1)乙二胺四乙酸二钠、黄原胶、1.3－丁二醇、维生素的材料先在沸水中杀菌15min，组成c部分；

16、2)按配方称量4g十八醇、聚二甲基硅氧烷、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组分成分，在沸水中充分溶解15min，组成d部分；

17、3)两相溶解充分后，降温至80℃，将c部分和d部分融合，在4000r/min转速下均质5min，冷却至45℃，加入增长生长因子合成溶液，加入孵育2h。

18、作为本发明所述一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：所述步骤三中，所述温度传感器实时监测恒温箱、培养器皿内培养基温度，所述转速传感器用于实时监测搅拌器搅拌溶液的转速，所述溶氧传感器用于实时监测氧气在溶液中的溶解量，所述ph传感器用于实时监测溶液中的ph酸碱度值。

19、作为本发明所述一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：所述步骤四中在细胞增殖过程中采用标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪检测细胞增殖情况。

20、作为本发明所述一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：所述步骤八中，对细胞的代谢活性进行检测；

21、所述细胞的活性检测的方式为，在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或alamarblue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲躜染料，通过分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况；

22、通过四种四唑盐进行检测：mtt、xtt、mts和wst1，mtt在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲赜晶体需要溶解在dmso或者异丙醇中，因此，mtt主要作为终点检测方法；

23、其他三种盐与alamarblue一样，都是可溶且无毒，它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变，其中xtt的效率较低，需要添加额外的因子；wst1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；alamarblue的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到，四唑盐和alamarblue氧化还原染料能够用于标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等仪器进行检测。

24、作为本发明所述一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：所述细胞培养剂j1样品采用的是蛋白质；

25、所述培养剂j2样品采用的是胎牛血清；

26、所述培养剂j3样品采用的平衡盐溶液；

27、所述培养剂j4样品采用的是脂质。

28、作为本发明所述用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：所述实验环境检测过程中，室内设置安装紫外线消毒灯，设置温度为18-26℃，湿度位置在70％以下，设置100级空气质量条件下进行细胞操作。

29、作为本发明所述一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：所述步骤八中，进行细胞增殖检测采用10倍镜下计数板四角大方格内细胞的总数量。

30、作为本发明所述一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法的一种可选方案，其中：所述步骤八中，在第二天开始，每隔24h取出孔板，随机选择3孔，吸取培养液，加入1ml胰酶消化细胞，然后加入1ml培养液中和胰酶的消化，制备单细胞悬液；

31、4)，用移液器吸取10μl稀释后的细胞悬液，加样到血细胞计数板上；

32、5)，采用10倍镜下计数板四角大方格内细胞的数量；

33、6)，按公式计算出细胞悬液的浓度，再根据原细胞悬液的体积计算出总细胞数，调整细胞浓度至1x10/ml；细胞浓度＝计数板四角大方格内细胞的数量/4x稀释倍数x10/ml；

34、重复4-6操作，计算每孔总细胞数，取平均值，得到活性细胞数量，进而配合细胞的代谢活性检测法，检测细胞增殖数量。

35、本发明具备以下有益效果：

36、1、该一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法，通过步骤一至步骤八，在采集细胞后进行分离、稀释得到样本a，并根据预设不同温度、搅拌速度、溶氧参数、ph参数等条件，加入培养液和不同物质的细胞培养剂j1-j4，和样本a进行融合，在融合过程中进行一次和二次细胞增殖检测，方便对溶液浓度进行调控，进而提高细胞增殖质量。

37、2、该一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法，通过设定温度、转速、溶氧比例、ph值，便于在细胞孵育分裂过程中，在可控制温度中进行，便于观察培养中的细胞是否生长良好，有无污染等情况，实时对实验环境进行监测，减少细胞培养过程中产生的感染情况。

38、3、该一种用于提高细胞增殖的细胞培养方法，在步骤三培养液和样本a融合后，观察样本a中细胞核的生长情况，并加入增殖生长因子后，检测细胞增殖情况，获得第一细胞增殖检测数据，在步骤四和步骤七的过程中，调配细胞培养剂，根据不同物质，加入融合样本，再次培养后，二次检测细胞增殖情况，用以分析不同物质对细胞增殖产生的效果和变化，且采用两种方式进行增殖检测，一种是细胞的代谢活性进行检测，一种是细胞数量检测，两种检测方法结合，使得平均数据更为精准，计数法便于测定细胞生长曲线，通过生长曲线，进行调配适合的营养液浓度，便于提高细胞增殖能力