一种甜菊糖苷糖基转移酶基因及其编码产物与应用

本发明涉及一种甜菊糖苷生物合成相关的糖基转移酶(udp-glycosyltransferases,ugt)基因，及甜菊糖苷生物合成途径中ugt基因及其编码产物与应用，属于植物基因工程领域。

背景技术：

1、甜菊糖苷(steviol glycosides,sgs)是一类从甜叶菊(stevia rebaudiana)中提取的二萜皂苷类天然产物，具有高甜度、低热量等特点，被称为继蔗糖、甜菜糖外的“世界第三糖源”，并且还具有广泛的生物活性，包括抗炎、抑菌以及降血糖等。由于甜菊糖及其衍生物价格相对低廉且易于大量提取制备，已被广泛应用于食品饮料、医药和有机化学等领域。

2、所有sgs生物合成均以甜菊醇为前体，在不同的ugts催化下，c13和c19位分别连接不同数量的葡萄糖基、鼠李糖基和木质糖基而形成各种具有不同性质的sgs。目前已知参与sgs生物合成的ugts编码基因有4个，即srugt85c2、srugt91d2、srugt74g1和srugt76g1。srugt85c2能够糖基化甜菊醇c13位羟基；srugt74g1糖基化甜菊醇骨架c19位羧基；srugt91d2负责催化葡萄糖之间的β-1,2糖苷键；srugt76g1负责催化葡萄糖之间的β-1,3糖苷键。尽管这些ugts的供体底物特异性较高，能特异性利用udp活化的葡萄糖，但是它们的受体底物特异性较差，一个ugt往往能够糖基化多种糖苷底物，尤其是srugt76g1，能识别多达8种糖苷底物，这些ugts在sgs生物合成途径中先后发挥作用、互相影响，形成了复杂的糖基化网络，使得甜叶菊体内含有超多60种甜菊糖苷，给糖苷制备分离带来较大干扰。

3、在目前已知的甜菊糖苷中，甜菊苷(stevioside,stv)和莱鲍迪a苷(rebaudiosidea，reb a)是最主要的两种糖苷成分。stv苷占叶片干叶重的5％～10％，甜度是蔗糖的110～270倍。srugt76g1糖基化stv苷后产生reb a苷，reb a苷占叶片干叶重2％～4％，甜度为蔗糖的180～300倍，味质上与蔗糖较为接近，并且几乎没有苦涩后味，口感和品质均优于stv。srugt91d2能糖基化reb a得到莱鲍迪d苷(rebaudioside d,reb d)，reb d是的甜味是蔗糖的350倍，几乎没有苦涩后味，甜味阈值低，但其含量仅占叶片干重的0.4-0.5％。同时，srugt76g1也能继续糖基化reb a苷产生莱鲍迪i苷(rebaudioside i,reb i)，而reb i苷的甜度并没有随着糖基化数量增多而升高，且苦涩后味也更显著。因此，如何提高srugt76g1的选择性，降低副产物糖苷的合成，提高reb d的累积，对于甜叶菊品种品质改良和体外酶催化甜菊糖苷合成具有重要的意义。

4、甜叶菊srugt76g1具有多态性，已有多篇文章报道过多种srugt76g1自然产生的突变体，但是这些突变体大多活性较低或为翻译中断的序列，仅srugt76g1(ncbi id：ay345974)具有较好的活性，但是选择性较差，体内体外均能催化不同底物产生多种糖苷产物。kim等曾通过位点饱和突变的方式对该酶进行改造，但是产生的38个突变体中副产物糖苷含量与野生型并无明显差别。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一个具有甜菊糖苷c13位选择性的糖基转移酶基因及其编码的蛋白质。本发明提供的新的甜叶菊ugt能够特异性在甜菊糖苷c13位葡萄糖上通过β-1,3糖苷键连接一个葡萄糖，而不能糖基化c19位葡萄糖，选择性的显著变化降低了甜菊糖苷糖基化产物的分离成本。并且，本发明提供的具有c13位选择性的β-1,3糖基转移酶在底物识别和进入催化空腔的方式上存在差异，为srugt76g1底物选择机制解析提供了理论和实验基础。将本发明的糖基转移酶在甜叶菊中过表达能为甜叶菊品种改良提供了新方向。

2、本发明提供了一种甜菊糖苷糖基转移酶，其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：

3、1)具有seq id no.1所示的氨基酸序列；

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11、advslmkggssyesleslvsyissl

12、2)具有seq id no.1从氨基端开始的第1-458位氨基酸残基序列；

13、3)对seq id no.1所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有甜菊糖苷糖基转移酶活性的氨基酸序列。

14、本发明还提供了一种甜菊糖苷糖基转移酶基因，编码权利要求1所述的甜菊糖苷糖基转移酶。

15、上述技术方案中，进一步地，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

16、1)具有seq id no.2所示的脱氧核糖核酸序列；

17、atggaaaataaaacggagaccaccgttcgccggcgccggagaataatattattcccggt

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41、2)编码seq id no.1氨基酸序列的脱氧核糖核酸序列；

42、3)对seq id no.2的脱氧核糖核酸序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有甜菊糖苷糖基转移酶活性的核苷酸序列；

43、4)与seq id no.2限定的脱氧核糖核酸(dna)序列的同源性达到80％及以上，且能编码甜菊糖苷糖基转移酶的脱氧核糖核酸序列。

44、本发明还提供了包含前述甜菊糖苷糖基转移酶基因的重组表达质粒。

45、本发明还提供了包含前述甜菊糖苷糖基转移酶基因的重组基因工程菌。

46、本发明还提供了一种制备甜菊糖苷糖基转移酶的方法，将前述甜菊糖苷糖基转移酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的甜菊糖苷糖基转移酶；

47、优选地，所述的重组表达甜菊糖苷糖基转移酶的表达载体，是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

48、上述技术方案中，进一步地，所述宿主细胞包括大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的一种。

49、本发明还提供了前述甜菊糖苷糖基转移酶在生产甜菊糖苷中的应用。

50、上述技术方案中，进一步地，所述甜菊糖苷产物为c13位具有β-1,3糖链的甜菊糖苷类化合物物；优选地，甜菊糖苷为甜菊双糖d(steviolbioside d)、莱鲍迪苷b(rebaudioside b)、莱鲍迪a苷(rebaudioside a)、莱鲍迪d苷(rebaudioside d)、莱鲍迪苷g(rebaudioside g)、莱鲍迪苷e4(rebaudioside e4)。

51、本发明还提供了前述甜菊糖苷糖基转移酶基因在甜叶菊遗传育种中的应用。

52、与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明公开了一个具有甜菊糖苷c13位选择性的糖基转移酶编码基因srugt76g6及其编码的蛋白。srugt76g6具有对c13位专一性糖基化的能力，而不能糖基化c19位，并对与c13位具有双糖基化的底物活性较高，对与c13位仅含单糖的糖苷，活性较弱。相对于不具有催化位点选择性的srugt76g1，应用本发明提供的具有c13位选择性的β-1,3糖基转移酶制备甜菊糖苷能显著降低甜菊醇糖苷糖基化产物的分离成本。本发明提供的具有c13位选择性的β-1,3糖基转移酶在底物识别和底物进入催化空腔的方式与srugt76g1相比发生变化，为β-1,3糖基转移酶底物选择机制解析提供了理论和实验基础。将本发明的糖基转移酶在甜叶菊中过表达能为甜叶菊品种改良提供了新方向。