TRBC2抗体及其应用的制作方法

本发明涉及抗体及其应用领域，具体涉及trbc2抗体及其应用。

背景技术：

1、从组织来源分辨，淋巴癌变大致上可以分为两类，即t细胞和b细胞来源。t细胞癌变临床及生物学意义上均较为异质，总体上各型t细胞淋巴瘤发病率低于b细胞淋巴瘤，在全体非霍奇金淋巴瘤中占10-20％，而在急性白血病中占20％。最常见的组织亚型包括外周t细胞淋巴瘤(peripheral t-cell lymphoma,ptcl-nos)，血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(angio-immunoblastic t-cell lymphoma,aitl)和间变性大细胞淋巴瘤(anaplasticlarge cell lymphoma,alcl)。而急性淋巴母细胞白血病(acute lymphoblasticleukaemias,all)病人群体中，约有20％为t细胞表型。

2、t细胞淋巴恶性肿瘤往往侵袭性强于b细胞淋巴瘤，病人5年生存率仅有30％，多与播散性发病、预后评分不良以及结外发病关联。单独化疗效果较差，现有疗法仅对不到30％的病人有效。

3、针对b细胞淋巴瘤，有抗cd20治疗性单抗，如利妥昔单抗(美罗华)可以极大改善治疗效果，而对t细胞淋巴瘤来说，目前尚无有效、低毒性的免疫治疗手段。这是因为，癌性(克隆化clonal)t细胞与正常t细胞表面标记物差别有限，开发特异性针对癌性t细胞的药物难度较大。在b细胞淋巴瘤药物开发中，也存在类似问题，但无差别的清除b细胞带来的免疫抑制效应相对较小，病人可以耐受，而且，正常b细胞长期清除带来的免疫球蛋白损失，可以通过输注外源性的igg获得补充。然而，类似的策略不能够应用于t细胞癌变的治疗---t细胞的清除往往造成严重的免疫抑制和严重副作用，并且，对t细胞的清除带来的副作用，尚无合理的临床补救措施。如alemtuzumab，其靶点为cd52，对t细胞肿瘤具有一定的治疗效果，但其应用却因带来严重细胞免疫缺陷副作用而受到限制，这种副作用主要归因于t细胞清除，病人的感染率大为升高。

4、因此有必要开发治疗t细胞来源淋巴瘤/白血病的新治疗手段。suman paμl(s.paμl et al.,sci.transl.med.10.1126/scitranslmed.abd3595(2021).)等人开发了一种t细胞接合器形式的双特异性抗体(bispecific antibody，bsab)，该型抗体一端特异性的靶向克隆性t细胞(肿瘤)表面的t细胞受体β分子的可变区，另一端靶向t细胞表面的cd3分子，从而介导正常t细胞对(t细胞)肿瘤的杀伤。这项研究是一次研发特异性针对t细胞肿瘤的有益尝试，颇具启发性。然而，该研究获得的两个bsab用于t细胞肿瘤却具有以下成药性方面的问题：

5、(i)由于t细胞β受体亚基可变区具有多态性，如果要做成货架(off-the-shelf)产品，则需要开发数十种分子实体(trbv编码基因共有68种，分属于30个家族)，效率较低。

6、(ii)采取scfv串联的形式，将针对t细胞受体β亚基可变区(trbv)和cd3亚基的两臂相连构建的双抗分子仅含有250个左右氨基酸，分子量小于30kd，药物代谢不具备优势，从而预测其临床给药不友好，病人依从性较差。

7、(iii)t细胞接合器形式的双抗诱发细胞因子风暴的几率较大，副作用发生率高且较严重。

8、(iv)t细胞接合器形式的双抗用于t细胞肿瘤的疗法，原则上，难以避免顺式结合出现，进一步加剧副作用；而反式结合诱导的杀伤过程，也会由于两个t细胞之间的受体-配体信号综合输出导致的药效/安全风险不完全可控。

9、paμl m maciocia等人曾开发了一种靶向trbc的car-t疗法(doi:10.1038/nm.4444)。但car-t疗法由于其苛刻的制备和储运条件，难以推广，且该方法在临床应用上仍难以避开以上所述的弊端。

10、细胞受体(t cell receptor,tcr)是t细胞表面的特异性受体，负责识别由主要组织相容性复合体(mhc)所呈递的抗原，与b细胞受体不同，并不能识别游离的抗原。通常情况下，t细胞受体与抗原间拥有较低的亲和力，因而同一抗原可能被不同的t细胞受体所识别，某一受体也可能识别许多种抗原。

11、t细胞受体的β亚基恒定区(trbc)仅有两种多态性，即trbc1或trbc2。带有trbc1或者trbc2的t细胞群体往往数量大致相同，有些情况下trbc1/2占到35-45％。这样一来，针对trbc1或trbc2进行靶向抗体药物开发并给药，则有望清除克隆化t细胞及与该癌性t细胞带有同样trbc肽段正常t细胞的同时，仍有望保留一半的t细胞群体，从而避免免疫抑制带来的副作用。trbc1和trbc2高度同源，两者胞外区有145个氨基酸，其中仅有5个氨基酸的差异，且分布于不同的结构域。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：如何有效治疗t细胞来源的癌症。

2、第一个方面，本发明提供特异性结合trbc2蛋白的抗体或其抗原结合片段，

3、所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列分别是seq idno.20第26-35位、seq id no.20第50-66位和seq id no.20第99-109位的hcdr1、hcdr2和hcdr3；所述轻链可变区包含氨基酸序列分别是seq id no.25第24-38位、seq idno.25第54-60位和seq id no.25第93-101位的lcdr1、lcdr2和lcdr3(10a5)；

4、或，所述重链可变区包含氨基酸序列分别是seq id no.27第26-33位、seq idno.27第51-58位和seq id no.27第97-107位的hcdr1、hcdr2和hcdr3；所述轻链可变区包含氨基酸序列分别是seq id no.30第27-32位、seq id no.30第50-52位和seq id no.30第89-97位的lcdr1、lcdr2和lcdr3(27b10)。

5、其中，hcdr1、hcdr2和hcdr3为重链可变区中的三个互补决定区(cdr)，lcdr1、lcdr2和lhcdr3为轻链可变区中的三个互补决定区(cdr)。互补决定区的序列根据kabat(10a5)或imgt(27b10)编号系统定义。

6、进一步地，上述的抗体或其抗原结合片段中，所述抗体可为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体中的任一种或几种。

7、进一步地，上述的抗体或其抗原结合片段中，所述重链可变区和轻链可变区可选自下述任一种：

8、a1)、所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no.20或与seq id no.20具有至少90％的同一性，所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no.25或与seq id no.25具有至少90％的同一性；

9、a2)、所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no.27或与seq id no.27具有至少90％的同一性，所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no.30或与seq id no.30具有至少90％的同一性；

10、a3)、所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no.5或与seq id no.5具有至少90％的同一性，所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no.6或与seq id no.6具有至少90％的同一性；

11、a4)、所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no.7或与seq id no.7具有至少90％的同一性，所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no.8或与seq id no.8具有至少90％的同一性。

12、进一步地，上述的抗体或其抗原结合片段中，所述抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可为igg1、igg2、igg3或igg4中的一种，所述轻链恒定区的类别可为κ链或λ链。

13、进一步地，上述的抗体或其抗原结合片段中，所述重链恒定区可为人或小鼠的igg1、igg2、igg3或igg4中的一种，所述轻链恒定区的类别可为人或小鼠的κ链或λ链。

14、进一步地，上述的抗体或其抗原结合片段中，所述重链恒定区可为人或小鼠的igg1，所述轻链恒定区的类别可为人或小鼠的κ链。

15、进一步地，上述的抗体或其抗原结合片段中，所述重链恒定区可为人的igg1，所述轻链恒定区的类别可为人的κ链。

16、进一步地，上述的抗体或其抗原结合片段中，所述抗原结合片段可为fab片段、fv片段、fab′片段、f(ab′)2片段、单链抗体(scfv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(mru)中的一种或其任意组合。

17、第二个方面，本发明还提供生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：

18、b1)、编码上述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区的核酸分子；

19、b2)、编码上述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子；

20、b3)、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子；

21、b4)、含有b1)-b3)任一所述核酸分子的表达盒；

22、b5)、含有b1)-b3)任一所述核酸分子的重组载体、或含有b4)所述表达盒的重组载体；

23、b6)、含有b1)-b3)任一所述核酸分子的重组微生物、或含有b4)所述表达盒的重组微生物、或含有b5)所述重组载体的重组微生物；

24、b7)、含有b1)-b3)任一所述核酸分子的细胞系、或含有b4)所述表达盒的细胞系、或含有b5)所述重组载体的细胞系。

25、进一步地，上述的生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：

26、c1)、核苷酸序列是seq id no.35的dna分子(编码hu10a5-33的重链可变区)；

27、c2)、核苷酸序列是seq id no.40的dna分子(编码hu10a5-33的轻链可变区)；

28、c3)、核苷酸序列是seq id no.9的dna分子(编码10a5的重链可变区)；

29、c4)、核苷酸序列是seq id no.10的dna分子(编码10a5的轻链可变区)；

30、c5)、核苷酸序列是seq id no.15的dna分子(编码hu10a5-33的重链)；

31、c6)、核苷酸序列是seq id no.16的dna分子(编码hu10a5-33的轻链)；

32、c7)、核苷酸序列是seq id no.42的dna分子(编码hu27b10-11的重链可变区)；

33、c8)、核苷酸序列是seq id no.45的dna分子(编码hu27b10-11的轻链可变区)；

34、c9)、核苷酸序列是seq id no.11的dna分子(编码27b10的重链可变区)；

35、c10)、核苷酸序列是seq id no.12的dna分子(编码27b10的轻链可变区)；

36、c11)、核苷酸序列是seq id no.51的dna分子(编码hu27b10-11的重链)；

37、c12)、核苷酸序列是seq id no.52的dna分子(编码hu27b10-11的轻链)。

38、第三个方面，本发明还提供药物组合物，所述药物组合物包含上述抗体或其抗原结合片段。

39、第四个方面，本发明还提供下述任一项所述的应用：

40、d1)、上述的生物材料在制备上述抗体或其抗原结合片段中的应用；

41、d2)、上述的生物材料在制备上述的药物组合物中的应用；

42、d3)、上述抗体，和/或，上述的生物材料，和/或，上述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗t细胞来源疾病的产品中的应用。

43、进一步地，上述的应用中，所述t细胞来源疾病可为t细胞淋巴瘤，包括t淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(t lymphoblastic leukemia/lymphoma)，皮肤t淋巴瘤(cutaneous t-cell lymphomas)，血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic t-celllymphoma，aitl)，间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma，alcl)，外周t细胞淋巴瘤-非特指型(peripheral t-cell lymphoma，not otherwise specified，ptcl-nos)等。

44、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

45、本文中，所述至少90％的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

46、术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)。所述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，所述抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，所述抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。

47、术语“fab片段”是由重链fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。将重链fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达fab抗体(fab片段)，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链fd指fab中约1/2的h链部分(约含225个氨基酸残基，包括vh、ch1和部分铰链区)。

48、术语“fv片段”是指可分别构建含有vh和vl基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性fv抗体；也可在载体中的vh和vl之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成fv抗体(fv片段)。

49、术语“fab′片段”含有一条轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab′)2分子。

50、术语“f(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab′片段组成。

51、术语“单链抗体(scfv)”是指用适当的寡核苷酸接头(linker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(scfv)。多肽链能自发折叠成天然构象，保持fv的特异性和亲和力。

52、术语“纳米抗体(单域抗体)”是指将抗体重链v区通过基因工程方法表达，获得仅含vh片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致。

53、术语“双特异性抗体”是指将两套轻链、重链基因导入骨髓瘤细胞中，选择合适的抗体恒定区及ig类型，可获得产量大、均一性和纯度高的双特异性抗体。另外，以化学交联技术或杂交-杂交瘤技术也可获得双特异性抗体。

54、术语“最小识别单位(mru)”是指仅含可变区中单一cdr结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。

55、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。

56、本文所述微生物可为酵母、细菌或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia),欧文氏菌(erwinia),根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium),产碱菌属(alcaligenes),假单胞菌属(pseudomonas),芽胞杆菌属(bacillus)等；酵母可为毕赤酵母(p.pastoris)。

57、所述细胞系(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞系具体可为293f细胞。

58、术语“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。

59、具有改善的亲和力和/或效价的本发明所述抗体的变体可通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的范围内。例如，氨基酸置换可用于获得具有进一步改善的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可用来改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法而优化抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也属于本发明的范围内。

60、本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的dna分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。

61、本领域技术人员熟知，所述抗原结合片段可以可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。

62、本发明取得有益技术效果如下：

63、获得了特异的针对trbc2，却不针对trbc1的鼠源抗体分子10a5和27b10，在人-鼠嵌合、鼠抗体人源化工程改造之后仍然保持亲和力和特异性。报告基因分析表明，10a5和27b10可以介导cd16a受体阳性的效应细胞对靶细胞的杀伤，从而具备抑制肿瘤的潜力。