一种METTL7B基因肺部特异性敲入小鼠模型的构建方法及其应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种mettl7b基因肺部特异性敲入小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一，发病率在所有恶性肿瘤中约占20％，死亡率约为27％，五年生存率仅8％～10％左右，随着环境污染以及其他因素恶化，肺癌发生率呈逐年上升趋势。肺癌的发病原因与多种机制相关：1)驱动基因(如egfr，kras)的异常表达和突变激活相应细胞信号通路，诱发并维持肿瘤细胞生长；2)肿瘤干细胞以其自我更新、增殖与分化能力和强致瘤性诱导肿瘤的发生,发展,侵袭,转移,复发和耐药的发生；3)癌症相关基因的表观遗传修饰异常导致癌基因的激活或高表达,而抑癌基因的失活或缺失；4)肿瘤dna的不稳定性和损伤的积累导致癌基因和染色体畸变，加速肿瘤的发生；5)肿瘤微环境(如细胞外基质、成纤维细胞等)为恶性肿瘤“种子”输入生长繁育的“肥沃土壤”，促进了肿瘤的发生和进展。在治疗上，即使靶向药的出现为肺癌患者带来了全新的希望，但是只有约40％患者携带符合靶向药的基因突变，仍有一半左右的患者需接受传统化疗或其他方法进行治疗。最新研究表明，利用铂类化疗或免疫治疗，非小细胞型肺癌(non-small-cell lungcancer，nsclc)患者5年生存率只有16％-23％。由此可见，肺癌发病机制非常复杂导致其防治形势依然非常严峻。因此，探索nsclc发生和发展的分子机制，对于深入了解其发病机制，以及疾病的防控和治疗都非常关键，也是提升治疗肺癌效果亟需解决的重大问题。

2、甲基化转移酶样蛋白(methyltransferase like，mettl)是含有s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl methionine，sam)结合域的蛋白家族，能将甲基化供体的甲基转移到rna、dna或蛋白等受体中，从转录后或翻译后水平调控底物的活性、定位和稳定性等重要的生物学特征和功能。mettl家族含有超过30名成员，目前研究只证实少数mettl家族分子能甲基化修饰细胞中的rna或蛋白，如mettl3、mettl13、mettl14、mettl8和mettl16等。这些蛋白在癌症的发生、个体发育、干细胞多能性等过程中都起着重要的调控作用，但其他成员的甲基化靶点和分子机制依然未知。

3、甲基化转移酶样蛋白7b是(methyltransferase like 7b，mettl7b)甲基化转移酶样家族成员之一，其蛋白结构包含一个s-腺苷基甲硫氨酸结合域(s-adenosylmethioninebinding site,sam binding site)。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何获得在肺组织特异性条件性表达mettl7b蛋白的工具小鼠模型。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了构建肺组织特异性条件性表达甲基化转移酶样蛋白7b的工具小鼠模型的方法。所述方法可包括将甲基化转移酶样蛋白7b(mettl7b)的基因表达盒导入受体小鼠的rosa26的编码基因中，得到转基因小鼠，将所述转基因小鼠与肺组织特异性条件性cre表达小鼠杂交获得所述肺组织特异性条件性表达甲基化转移酶样蛋白7b的工具小鼠模型。所述工具小鼠模型可在诱导cre酶表达条件下在肺组织中特异性表达甲基化转移酶样蛋白7b。

3、所述，工具小鼠模型在其他组织中可不表达甲基化转移酶样蛋白7b。所述基因表达盒可含有甲基化转移酶样蛋白7b的编码序列。所述基因表达盒可在启动子序列和甲基化转移酶样蛋白7b的编码核苷酸序列之间含有lox侧翼序列和终止子序列。

4、所述肺组织特异性条件性cre表达小鼠在诱导cre酶表达条件下可在肺组织中特异性表达cre酶。

5、所述条件性表达可为在诱导cre酶表达条件下表达。所述诱导cre酶表达条件可为使用药物诱导cre酶表达。所述药物可为他莫昔芬。

6、上述方法中，所述甲基化转移酶样蛋白7b蛋白可选自下述任一种蛋白质：

7、a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

8、a2)将a1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有谷氨酸脱羧酶活性的蛋白质；

9、a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

10、上述方法中，所述甲基化转移酶样蛋白7b蛋白的编码序列可为、、序列2所示的dna分子。所述甲基化转移酶样蛋白7b蛋白的编码序列也可为序列表中序列3的第5565-6299位所示的dna分子。

11、上述方法中，所述基因表达盒可含有cag启动子。所述特异性导入可为将所述基因表达盒敲入受体小鼠的mettl7b基因的核苷酸序列。

12、所述mettl7b基因可为genbank accession no.nm_027853.2(update date29-may-2022)，即序列表中序列2所示的核苷酸。

13、上述方法中，所述导入可包括采用crispr/cas9系统将所述基因表达盒导入受体小鼠受精卵的rosa26编码基因中。

14、上述方法中，所述导入可包括将表达靶向所述rosa26编码基因的grna的核酸分子、cas9蛋白和所述基因表达盒通过显微注射导入所述受体小鼠受精卵，得到所述转基因小鼠的步骤。

15、上述方法中，所述grna的靶序列具体可为序列表中序列4所示。

16、上述方法中，所述lox侧翼序列和终止子序列可为序列表中序列3的第4615-5524位核苷酸。

17、上述方法中，所述基因表达盒的核苷酸序列可为序列表中序列3。

18、所述受体小鼠可为c57bl/6小鼠。所述肺组织特异性条件性cre表达小鼠可为肺组织特异性cre转基因小鼠sftpc-creert2。

19、下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

20、b1)上文所述所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在制备、开发或研究肺部疾病相关药物中的应用；

21、b2)上文所述所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在制备肺部疾病临床实验用药中的应用；

22、b3)上文所述所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在研究甲基化转移酶样蛋白7b调控相关的肺部疾病发明机制中的应用；

23、b4)上文所述所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在研究物质在抗肺炎和/或抗肺纤维化和/或抗肺癌评价中的应用。

24、所述肺部疾病可为肺炎、肺癌、肺纤维化等疾病。所述物质可为药物、基因、微生物、气体、食物、食物添加剂或医疗器械等。

25、本发明的目的在于提供一种mettl7b肺组织特异性条件性敲入小鼠模型的构建方法、模型的制备及其应用。

26、本发明提供的mettl7b基因条件性敲入小鼠模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：

27、(1)基于crispr/cas9系统，设计特异性位点导向grna，体外转录grna和cas9mrna，所述的grna的核苷酸序列可为5’-ctccagtctttctagaagatggg-3’；

28、(2)构建cag-loxp-stop-loxp-kozak-mouse mettl7b cds-polya基因表达盒的基因敲入载体；

29、(3)将grna、cas9 mrna和基因敲入载体导入小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠。

30、(4)通过southern blot、pcr扩增鉴定f0代小鼠，获得f0代小鼠。

31、(5)将f0代小鼠与野生型小鼠交配获得f1代小鼠。提取f1代小鼠尾部组织dna，经过pcr，测序鉴定，获得mettl7b条件性敲入f1杂合子小鼠。

32、(6)将f1代杂合子小鼠交配并经过pcr扩增鉴定获得f2代mettl7b条件性敲入的纯合子小鼠。

33、(7)用肺组织特异性cre转基因小鼠sftpc-creert2与mettl7b敲入f2纯合子代小鼠进行交配，经过pcr扩增鉴定，获得mettl7b肺部特异性敲入的杂合子小鼠。将mettl7b肺部特异性敲入的杂合子小鼠近交，获得mettl7b肺部特异性敲入的纯合子小鼠mettl7b flox/flox sftpc-creert2。

34、本发明所提供的构建在肺组织特异性条件性表达甲基化转移酶样蛋白7b的工具小鼠模型的方法及构建的工具小鼠模型，可应用于深入研究mettl7b在肺癌肿瘤中的作用机制，开发新型靶点药物对临床肿瘤治疗提供一种探索性科学理论依据。

35、本发明相对现有的技术具有如下显著的进步：

36、本发明首次提供mettl7b基因的条件性敲入小鼠动物模型及其构建方法，通过mettl7b敲入小鼠与不同类型cre小鼠的杂交，可实现对小鼠特定组织或细胞的敲入，可用于实现mettl7b在不同疾病模型的构建以及药物筛选中，推动肿瘤的诊治、生物学、药物等领域的进步和完善。

37、本发明首次提供mettl7b基因的肺部条件性敲入小鼠动物模型及其构建方法，可实现在小鼠肺部at2细胞特异性表达mettl7b，对mettl7b在肺炎、肺癌、肺纤维化等肺部疾病模型的构建、基因表达谱的研究、发病机制、药物筛选等领域具有促进作用。