一种高产L-岩藻糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

本发明涉及一种高产l-岩藻糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术：

1、l-岩藻糖(6-脱氧-l-半乳糖)是一种天然的脱氧己糖，存在于多种生物中，是哺乳动物细胞产生的许多n-和o-连接的聚糖和糖脂的重要组成部分，是构成母乳寡糖(hmos)的五种基本单糖之一，是母乳中高度丰富的非偶联聚糖。除此之外，l-岩藻糖还是植物和细菌细胞壁多糖的常见成分，是海藻多糖岩藻多糖的基本亚单位之一。l-岩藻糖具有多种生理作用，在肠道健康和疾病方面具有重要意义。此外，l-岩藻糖还能够调节脂质代谢和体重，作为抗肿瘤和免疫治疗的糖类调节剂。目前已有研究使用大鼠作为模型进行了l-岩藻糖的安全性评估，试验结果表明l-岩藻糖是非遗传毒性的，可作为食品工业中的功能性成分。

2、l-岩藻糖可以由廉价的单糖化学合成，但是化学合成具有耗时、不环保且产量低的缺陷。另外，可以通过从海藻中提取得到富含l-岩藻糖的岩藻多糖，岩藻多糖的酸水解和高效分离技术也可以有效地生产l-岩藻糖。利用l-岩藻多糖作为底物进行酶促反应，也可以得到l-岩藻糖，但是该方法中的底物l-岩藻多糖比产物l-岩藻糖更昂贵，因此无法投入实际的工业化生产中。目前，通过代谢工程微生物合成l-岩藻糖已受到关注，从用于2′-岩藻基乳糖合成的代谢工程大肠杆菌株的出发，使用外源添加的乳糖作为糖基受体合成2′-岩藻基乳糖，再进一步引入特异性的α-l-岩藻糖苷酶，将2′-岩藻基乳糖水解为l-岩藻糖和乳糖，但此方法目前研究报道的产量较低，经过168h的上罐发酵最高产量为16.7g/l，产率为0.1g/l/h，仍然无法实现l-岩藻糖的大规模工业化生产。

技术实现思路

1、作为极具前景的绿色合成策略，本发明利用代谢工程打造更高效的生产菌株是极有潜力的l-岩藻糖制备方式。基于目前报道的高产2′-岩藻糖基乳糖的菌株，引入了三种不同的α-l-岩藻糖苷酶，并通过基因敲除以及基因组整合的代谢工程方法构建工程菌株，以期得到高产的l-岩藻糖工程菌。

2、针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种高效生产l-岩藻糖的重组大肠杆菌及其构建方法。

3、本发明选择了以一高产2′-岩藻糖基乳糖的工程菌作为改造菌株，该菌在bl21(de3)宿主菌中进行了lacz和wcaj基因的敲除，利用prsfduet-1载体游离表达了gmd、wcag、manb和manc，利用petduet-1载体游离表达了wbgl，使用来源于大肠杆菌k-12mg1655的rcsa、rcsb正转录调控因子对mana、manb、manc、gmd以及wcag基因进行调控。且利用强启动子pj23119启动基因组上manc-manb基因簇的表达，并在大肠杆菌的reca位点整合利用强启动子pj23119启动表达的wbgl。从该菌株出发，利用pcdfduet-1载体游离分别表达来源于两歧双歧杆菌的afca，土壤宏基因组筛选得到的mfuc5或来源于thermotogamaritimamsb8的tmαfuc，即三种不同来源的α-l-岩藻糖苷酶(核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.3所示)，发现afca具有更强的2′-岩藻糖基乳糖的分解能力，且能得到更高产量的l-岩藻糖。之后又进一步敲除了在该工程菌中的l-岩藻糖分解代谢通路基因，即rhaa、fuci和fuck，并基于2′-岩藻糖基乳糖略有残留的实验现象，在arsb位点整合利用强启动子pj23119启动表达的afca(图1)。经过上述优化步骤后，在摇瓶培养中，工程菌株生产l-岩藻糖的产量为6.31g/l，在5l发酵罐中，l-岩藻糖的产量达到51.05g/l，产率达到0.76g/l/h，是迄今报道的最高值，表明其具有投入工业化生产的潜力。

4、本发明的第一个目的是提供一种生产l-岩藻糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌游离表达了α-l-岩藻糖苷酶编码基因，敲除或抑制鼠李糖异构酶编码基因rhaa、基因簇fuci-fuck，整合表达α-l-岩藻糖苷酶编码基因。

5、在一种实施方式中，在arsb位点整合表达α-l-岩藻糖苷酶编码基因。

6、在一种实施方式中，利用强启动子pj23119启动表达α-l-岩藻糖苷酶编码基因。

7、在一种实施方式中，所述α-l-岩藻糖苷酶的核苷酸序列如seq id no.1～seq idno.3任一所示。

8、在一种实施方式中，所述α-l-岩藻糖苷酶的核苷酸序列如seq id no.1所示。

9、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pcdfduet-1质粒为表达载体。

10、在一种实施方式中，利用pcdfduet-1载体游离表达α-l-岩藻糖苷酶。

11、在一种实施方式中，所述arsb基因的genbank号为np_417959.4。

12、在一种实施方式中，所述鼠李糖异构酶rhaa的ncbi序列号为yp_026276.1。

13、在一种实施方式中，所述基因簇fuci-fuck编码岩藻糖异构酶fuci和l-岩藻糖激酶fuck。

14、在一种实施方式中，所述岩藻糖异构酶fuci的ncbi序列号为np_417282.1，所述l-岩藻糖激酶fuck的ncbi序列号为np_417283.2。

15、在一种实施方式中，所述鼠李糖异构酶编码基因rhaa的核苷酸序列如seq idno.4所示，基因簇fuci-fuck的核苷酸序列如seq id no.5所示。

16、在一种实施方式中，所述强启动子pj23119的核苷酸序列如seq id no.6所示。

17、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌bl21(de3)。

18、在一种实施方式中，所述大肠杆菌为bwlwc，已公开于公开号为cn114874964a的中国专利申请文件中。

19、本发明的第二个目的是提供了一种生产l-岩藻糖的方法，所述方法是利用所述重组大肠杆菌发酵生产l-岩藻糖。

20、在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液添加至含有20g/l甘油的发酵体系中，35～38℃，180～220rpm，培养至od600＝0.8±0.1，加入终浓度为0.05～1.0mmiptg，同时加入终浓度为3～15g/l乳糖，25℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。

21、在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液接种到含有20～40g/l甘油的发酵罐体系中，发酵体系的发酵温度35～38℃，搅拌转速100～800r/min，通气量2～8vvm，ph控制在6.8±0.2，发酵至od60012～16，加入终浓度为5～10g/l乳糖和终浓度为0.05～0.2mm的iptg，在25～28℃下诱导培养不少于70h。

22、在一种实施方式中，在发酵罐体系反应过程中补加甘油，以维持甘油浓度不低于1g/l，且不超过10g/l。

23、在一种实施方式中，甘油采取一定速率的流加，在甘油不足时提高流加补料频率，在甘油过多时降低流加频率，以此来维持菌体的生长。

24、在一种实施方式中，在初始添加8g/l的乳糖作为2′-岩藻糖基乳糖的合成底物，2′-岩藻糖基乳糖又分解产生乳糖，因此乳糖作为运转底物，其浓度保持一定程度的稳定。

25、在一种实施方式中，所述发酵体系或发酵罐体系中还含有4.0g/l磷酸氢二氨，13.5g/l磷酸二氢钾，1.4g/l七水硫酸镁，1.7g/l柠檬酸和10ml/l微量金属元素；微量金属元素包括：0.35g/l一水硫酸锰，10g/l硫酸亚铁，1.0g/l无水硫酸铜，2.25g/l七水硫酸锌，2.0g/l二水氯化钙，0.23g/l十水硼酸钠和0.11g/l钼酸铵。

26、本发明的第三个目的是提供了核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.3任一所示的α-l-岩藻糖苷酶在制备l-岩藻糖或含有l-岩藻糖的产品中的应用。

27、在一种实施方式中，以乳糖为底物，利用所述α-l-岩藻糖苷酶，生产l-岩藻糖。

28、本发明的第四个目的是提供了所述重组大肠杆菌在制备l-岩藻糖含有l-岩藻糖的产品中的应用。

29、本发明的第五个目的是提供了所述重组大肠杆菌在食品、化工、医药领域中的应用。

30、有益效果：

31、本发明以改造后的高产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌bl21(de3)工程菌为出发菌株，通过表达三种不同来源的α-l-岩藻糖苷酶，并对l-岩藻糖的合成通路做了一系列代谢工程改造，最终得到的重组大肠杆菌在摇瓶发酵条件下l-岩藻糖产量达6.31g/l，分批补料培养条件下，发酵66.8hl-岩藻糖产量即可达51.05g/l，产率达到0.76g/l/h。