一种特异性结合E2-E2抗体复合物的抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和医学，尤其是涉及一种抗雌二醇(e2)-雌二醇抗体复合物的抗体及其应用。

背景技术：

1、雌二醇(estradiol，e2)是固醇类激素，其基本骨架为甾体结构，即环戊烷多氢菲，由三个环己烷和一个环戊烷稠合而成。雌二醇是雌激素中最主要且生物活性最强的激素，其对哺乳动物的生殖系统、免疫反应和基因表达等方面起着重要作用。在血液中e2在男女的各种临床状况中均是重要的诊断标志物。

2、临床上，e2水平用于评估女性的月经失调，性早熟或青春期延迟以及卵巢功能，多毛症、多囊卵巢综合症，同时在妊娠相关疾病监测中，监测整个妊娠期间的e2水平，联合孕酮和抑制素b水平，预测妊娠患者葡萄胎的风险。男性e2的检测可用于男性乳房发育评估，青春期延迟或不育等。

3、目前临床上检测e2的主流方法学为免疫分析法，由于e2属于激素类小分子化合物，抗原决定簇单一，无法支持两个不同的抗体进行夹心检测，因此临床免疫测定一般采用竞争法。

4、然而，竞争法检测小分子抗原存在灵敏度和抗干扰能力差的问题，尤其是对低值样本检出能力较差。因此亟需解决现有竞争法检测e2的灵敏度低、抗干扰能力差的问题，并提高低值样本的检出率。

5、目前较为可行复合物抗体夹心法，具体的检测原理为，一株抗e2抗体(第一抗体)与待测抗原形成免疫复合物，另一株抗复合物抗体(第二株抗体)与前述免疫复合物结合形成免疫夹心复合物，识别位点为第一株抗体和小分子半抗原结合后形成的新表位，且要求复合物抗体与游离的第一株抗体和小分子半抗原均无结合。通过复合物抗体夹心法的运用，可以极大提高小分子抗原检测的灵敏度和准确度。然而筛选复合物抗体的难度较大，适用于夹心法的高亲和力复合物抗体目前暂未有报道。

技术实现思路

1、以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

2、本技术提供了一种抗雌二醇(e2)-雌二醇抗体复合物的抗体及其应用。本技术提供的抗雌二醇(e2)-雌二醇抗体复合物的抗体能够与e2抗原特异性结合，具有较好的结合活性和亲和力。通过使用本技术中的抗体进行夹心法检测e2，大大提高了夹心法检测的检测灵敏度和抗干扰能力，并且提高了低值样本的检出率。

3、在一个方面中，本技术提供了一种特异性结合e2-e2抗体复合物的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括以下互补决定区：

4、互补决定区cdr1-vh，其氨基酸序列为sygvh(seq id no:1)；

5、互补决定区cdr2-vh，其氨基酸序列为viwx1ggstnynsalms(seq id no:19)，其中x1是a或g；

6、互补决定区cdr3-vh，其氨基酸序列为x2egx3ax4amdy(seq id no:20)，其中x2是d或g，x3是y、s或t，x4是g或y；

7、互补决定区cdr1-vl，其氨基酸序列为rasesvdnfgisfmn(seq id no:8)；

8、互补决定区cdr2-vl，其氨基酸序列为x5asnqgs(seq id no:21)，其中x5是a或t；

9、互补决定区cdr3-vl，其氨基酸序列为qqskevpx6t(seq id no:22)，其中x6是y、w或r。

10、在本技术的实施例中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

11、

12、

13、在本技术的实施例中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自以下野生型或突变组合中的任一种：

14、

15、

16、

17、

18、在本技术的实施例中，所述抗体或其功能性片段与所述e2-e2抗体复合物以kd≤e-8数量级的亲和力结合。

19、在本技术的实施例中，所述抗体包括序列依次如seq id no:11-14所示的轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l；和/或，序列依次如seq id no:4-7所示的重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h。

20、在本技术的实施例中，所述抗体还包含恒定区。

21、在本技术的实施例中，所述恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd中的任何一种的恒定区。

22、在本技术的实施例中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

23、在本技术的实施例中，所述恒定区来源于小鼠。

24、在本技术的实施例中，轻链恒定区序列如seq id no:18所示，并且重链恒定区序列如seq id no:17所示。

25、在本技术的实施例中，所述功能性片段选自所述抗体的f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种。

26、上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过例如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本技术公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

27、上述抗体的功能性片段还可以通过本领域技术人员已知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，诸如applied biosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

28、在另一方面中，本技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述抗体或其功能性片段。

29、在另一方面中，本技术提供了一种载体，其包含上述核酸分子。

30、在另一方面中，本技术提供了一种宿主细胞，其包含上述核酸分子，或者包含上述载体。

31、在另一方面中，本技术提供了如上所述的抗雌二醇(e2)-雌二醇抗体复合物的抗体或其功能性片段、上述核酸分子、上述载体或上述宿主细胞在制备检测e2的产品中的应用。

32、在另一方面中，本技术提供了一种e2检测试剂盒，所述试剂盒包括上述抗体。

33、在另一方面中，本技术提供了一种用于检测测试样品中的e2的量的方法，包括：

34、a)在足以发生抗体和抗原结合反应的条件下，使抗e2的第一抗体与所述测试样品中的e2抗原接触以形成免疫复合物；和

35、b)使上述抗体或其功能性片段与来自步骤a)的所述免疫复合物结合以形成免疫夹心复合物；以及

36、c)通过检测所述免疫夹心复合物的量来确定所述e2抗原的量。

37、在本技术的实施例中，所述方法选自以下中的任意一种或多种：荧光免疫法、化学发光免疫法、胶体金免疫法、放射免疫法或酶联免疫法；

38、优选地，所述化学发光免疫法为化学发光免疫夹心法；

39、优选地，所述方法采用半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪进行分析。

40、在本技术的实施例中，所述样品选自全血、血清或血浆中的至少一种；

41、优选地，所述全血、血清或血浆来源于外周血。

42、本技术提供的特异性结合e2-e2抗体复合物的抗体能够与e2-e2抗体复合物特异性结合，具有较好的结合活性和亲和力。通过使用本技术中的抗e2-e2抗体复合物抗体进行夹心法检测e2，大大提高了e2检测灵敏度和抗干扰能力，并且提高了低值样本的检出率。

43、本技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本技术而了解。本技术的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。