一种睾酮单克隆抗体的制备及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种睾酮单克隆抗体的制备及其应用。

背景技术：

1、睾酮是人体内主要性激素之一，由睾丸间质细胞产生，由毛细血管或静脉输送至外周，或穿过睾丸肌样细胞浸润产生精子的曲细精管。男性血液循环中，95％的睾酮是由睾丸分泌的，女性的卵巢与肾上腺可分泌少量睾酮，但血液循环中的睾酮大多是由雄烯二酮代谢产生。睾酮含量的测定主要用于男性性早熟、青春期发育迟缓、性腺机能减退、无精症或少精症等男性疾病的辅助诊断。睾酮一般在体内不能储存，通常是被迅速地利用或降解，因此在体内的含量极少，用一般的化学方法难以测定。目前常用的检测方法为液相色谱法或紫外分光光度法，但这两种检测方法步骤繁琐，检测时间长，不能广泛应用于临床的快速诊断。而利用单克隆抗体是解决这个问题的最好途径。

2、从免疫文库中筛选小分子睾酮单克隆抗体是较为广泛的方法。在抗体开发过程中，因小分子抗原无免疫原性，因此想要得到明确抗原决定簇的抗体，需偶联载体蛋白后进行动物免疫。噬菌体展示技术是将免疫后的免疫器官中的整套编码抗体基因序列通过分子克隆技术整合到载体上，形成抗体文库，以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面，通过多轮的筛选可获得特异性抗体。利用噬菌体展示技术筛选稳定性好、特异性高的睾酮单克隆抗体对于男性疾病的临床诊断具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种睾酮单克隆抗体的制备及其应用。本发明提供的单克隆抗体应用于血清样本检测，可快速、特异、灵敏的检测临床血清中睾酮的浓度，可用于临床诊断。

2、本发明提供的睾酮单克隆抗体，是通过将睾酮衍生物(t-3-cmo)偶联载体蛋白后进行动物免疫并经过噬菌体展示平台获得的，经测序鉴定其轻链的三个cdr区分别具有如seq id no:1～3所示的氨基酸序列，其重链的三个cdr区分别具有如seq id no:4～6所示的氨基酸序列；

3、进一步的，所述睾酮单克隆抗体具有如seq id no:7所示的轻链可变区和如seqid no:8所示的重链可变区；

4、所述睾酮单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区；所述轻链恒定区为κ型；所述重链恒定区为兔igg型。

5、本发明提供的睾酮单克隆抗体优于其他抗体，实验结果表明，本发明所述的睾酮单克隆抗体的特异性更好。将所述睾酮单克隆抗体应用到试剂盒中，发现其准确性、灵敏度、稳定性、精密性和回收率性能均优于其他抗体制得的试剂盒和市售试剂盒。

6、本发明提供了编码所述睾酮单克隆抗体的核酸，具体包括：

7、编码所述睾酮单克隆抗体轻链可变区的核酸具有如seq id no:9所示的序列；

8、编码所述睾酮单克隆抗体重链可变区的核酸具有如seq id no:10所示的序列；或

9、与seq id no:9～10所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与seq id no:9～10所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列。

10、本发明中，所述的核酸可以是dna、rna、cdna或pna。在本发明实施例中，所述核酸为dna形式。所述dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。所述dna可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。所述rna形式为由基因转录获得的mrna等。

11、本发明提供了表达模块，其包括启动子、终止子和本发明所述的核酸。

12、进一步的，所述的表达模块包括本发明所述的核酸以单个或多个串联形式与所述启动子、终止子组成的表达模块，本发明对此不做限定。

13、本发明中还提供了含有所述的核酸或所述的表达模块的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的dna序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(a)信号等。

14、本发明还提供了重组载体，其包括：

15、载体骨架和本发明所述的核酸；或

16、载体骨架和本发明所述的表达模块。

17、本发明所述的重组载体，是指核酸载体，是一种重组dna分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对细菌中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知细菌细胞利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。

18、本发明提供了宿主，其包括如下i)～iii)所示中的至少一种：

19、i)、分泌本发明所述的睾酮单克隆抗体；

20、ii)、基因组整合本发明所述的核酸或本发明所述的表达模块；

21、iii)、转染或转化本发明所述的重组载体。

22、本发明中，重组载体转染或转化进入宿主；所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。

23、进一步的，本发明所述的宿主包括细菌、真菌、病毒或动物。所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌；所述革兰氏阳性菌包括但不限于大肠杆菌。所述真菌包括霉菌、酵母、蕈菌；所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母、毕赤酵母和假丝酵母等。所述病毒包括但不限于包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、朊病毒。所述动物包括人、鼠、兔、猪、斑马鱼等。

24、本发明提供了所述的睾酮单克隆抗体的制备方法，包括培养本发明所述的宿主，获得所述单克隆抗体。

25、本发明提供了所述睾酮单克隆抗体与介质偶联形成的偶联物。

26、具体的，本发明所述的睾酮单克隆抗体与介质偶联形成的偶联物，所述介质包括放射性核素、多肽毒素、药物分子或载体。所述多肽毒素包括植物毒素、细菌毒素和动物毒素。所述药物分子包括阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。所述载体是指任何能够负载单克隆抗体的承载体，例如磁微粒、试纸条、聚苯乙烯平板或酶标板等。

27、本发明提供了所述睾酮单克隆抗体经化学标记或生物标记形成的复合物。

28、具体的，本发明所述的睾酮单克隆抗体经化学标记或生物标记形成的复合物，所述化学标记包括同位素标记、荧光素标记；所述生物标记包括酶标记、生物素标记。例如异硫氰酸荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、biotin、胶体金等。

29、本发明提供了如下a)～h)所示中的至少一种在制备睾酮激素检测试剂盒中的应用。

30、a)、本发明所述的睾酮单克隆抗体；

31、b)、本发明所述的核酸；

32、c)、本发明所述的表达模块；

33、d)、本发明所述的重组载体；

34、e)、本发明所述的宿主；

35、f)、本发明所述的制备方法制得的含有所述睾酮单克隆抗体的培养物；

36、g)、本发明所述的偶联物；

37、h)、本发明所述的复合物。

38、在本发明的一些实施例中，所述睾酮激素检测试剂盒包括本发明所述的睾酮单克隆抗体，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液和/或显色液。

39、本发明还提供了检测睾酮激素的产品，其原料包括如下a)～f)所示中的至少一种：

40、a)、本发明所述的睾酮单克隆抗体；

41、b)、本发明所述的核酸；

42、c)、本发明所述的表达模块；

43、d)、本发明所述的重组载体；

44、e)、本发明所述的宿主；

45、f)、本发明所述的制备方法制得的含有所述睾酮单克隆抗体的培养物。

46、g)、本发明所述的偶联物；

47、h)、本发明所述的复合物。

48、进一步的，本发明所述的产品还包括溶剂和/或辅料，所述溶剂和/或辅料应用于所述产品中，用于维持所述原料的稳定性或帮助所述原料发挥作用。

49、进一步的，所述溶剂包括但不限于tb缓冲液、pbs缓冲液、tris缓冲液、kcl缓冲液或nacl缓冲液。所述辅料包括但不限于蛋白、载体、抗氧化剂、表面活性剂和/或蛋白酶抑制剂；所述蛋白包括但不限于bsa；所述载体包括但不限于用于病毒包装的辅助载体、用于噬菌体包装的辅助载体，和/或用于真核或原核宿主细胞基因组整合的辅助载体，本发明对此不做限定；所述抗氧化剂包括但不限于dtt或β-巯基乙醇。所述的表面活性剂包括但不限于triton-x-100。所述的蛋白酶抑制剂包括但不限于pmsf。

50、本发明还提供了检测睾酮激素的方法，包括利用本发明所述的产品对样本进行检测。

51、本发明利用噬菌体展示技术，筛选获得了睾酮单克隆抗体。该单抗特异性强，检测灵敏度高，解决了睾酮激素在样本中含量低、检测难度大的问题。利用该单克隆抗体进行重复多次检测，实验结果表明该抗体稳定性及重复性良好，精密性和准确性高，能够广泛应用于男性疾病的临床诊断。