基于CRISPR/Cas12a系统的家蚕微孢子虫可视化检测方法及其试剂盒

本发明属于病原检测，具体涉及基于crispr/cas12a系统的家蚕微孢子虫可视化检测方法及其试剂盒。

背景技术：

1、蚕病的种类较多，其中，家蚕微粒子病可通过经口与创伤等感染途径在家蚕群体内发生大规模传染，5-7天内引起家蚕的大批死亡，并可经蚕卵垂直传播给下一代。历史上，法国、意大利等欧洲国家的蚕桑产业就是毁于这种疫病，因此，家蚕微粒子病被列为蚕种生产唯一的检验检疫对象。目前，家蚕病原菌的诊断技术相对落后，世界各国仍然沿用法国科学家巴斯德于1865年创建的母蛾镜检方法，该方法耗时耗力，且在准确性、时效性和灵敏性上均存在不足。近年来，虽然国内外研究者对于家蚕病原菌的诊断方法进行了大量的研究，包括免疫学技术检测、电镜检测、pcr检测、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，lamp)等，这些方法的检测特异性和灵敏性虽较传统方法均有较大提高，但都存在一定的缺陷。如电镜和pcr检测，通常需要昂贵的仪器设备和复杂的实验步骤，对检测人员的要求较高；lamp技术对操作环境要求高，反应过程极易被气溶胶污染，造成假阳性。因此，上述方法还无法成为常规检测方法。目前生产上对家蚕微粒子病的诊断大多依靠典型症状的肉眼判断，辅以显微镜镜检。

2、2018年2月，chen等人首次报道了cas12a具有在切割靶标dna后，切割体系内ssdna的活性。因此，基于此研究，crispr/cas12a核酸检测系统应运而生。该系统自开发以来，不仅在提高检测结果的可靠性方面表现出超高的灵敏度和单碱基分辨率的特异性，还因其极短的检测时间、便携式的设计和低廉的检测成本等特点迅速从众多核酸检测技术中脱颖而出，受到了广大研究者及基层医疗机构的高度重视与青睐。该系统主要包括以下五种关键组分：靶标dna、crrna、cas12a蛋白、ssdna报告分子和反应缓冲液。靶标dna可通过rpa技术得到富集，crrna则可根据cas12a蛋白及相应的靶标dna序列进行设计并体外合成或体外转录，cas12a蛋白通常由体外表达纯化获得，ssdna报告分子则需根据不同的检测目的进行不同的设计，从而实现低廉、可视化检测。检测方法主要有两种，即荧光检测与免疫层析检测。

3、目前该技术已成功应用于新冠肺炎、寨卡病毒、登革热病毒、甲型流感、恶性虐原虫、非洲猪瘟等多种重大疾病的可视化快速诊断，如chen等人则利用cas12a的“旁切活性”，建立了detectr检测平台，该平台将cas12a与rpa技术结合在一起，可在常温下快速、特异性地检测靶标hpv16和hpv18 dna。该系统成功区分了在pam序列附近具有6个碱基对差异的hpv16和hpv18，可用于检测含病毒分子较少的唾液、尿液、血液等样本。li等人则利用cas12a的顺式切割和反式切割活性，以自淬灭的荧光ssdna报告分子作为探针，开发了特异性核酸检测方法，即holmes(one-hour low-cost mμltipurpose highly efficientsystem)方法。该方法可用于检测与人相关的多个snp位点及某些dna病毒和rna病毒，且成本低廉，有望应用于核酸快速检测领域。此外，nouri等人将cas12a切割活性和固体纳米孔传感器相结合，开发了scan(solid-state crispr-cas12a-assisted nanopores)检测方法。通过玻璃纳米孔传感器，可定量分析体系中由cas12a降解的单链环状dna。该方法适用于检测hiv-1dna，具有扩展到其它类型的纳米孔和dna靶标检测中的应用前景。为了更加便捷、准确地对实际样本进行检测，基于crispr/cas12核酸检测系统的一步法检测平台逐渐被开发出来。例如，ding等人将rpa技术技术与cas12a检测相结合，开发了aiod-crispr(all-in-one dual crispr-cas12a)一步法检测平台。反应体系中，rpa的扩增和cas12a的特异性结合同时进行，通过cas12a的非特异性切割，可产生便于检测的荧光信号。该方法可用于检测sars-cov-2。

4、与传统的核酸检测技术相比，crispr/cas12a系统的优势明显，开辟了新一代现场快速核酸检测的应用市场，但该技术在昆虫病原菌的检测上未见报道。目前家蚕微孢子虫现场检测还存在低特异性、低灵敏度、成本高、易污染等问题。

技术实现思路

1、发明目的：为解决现有技术存在的问题，本发明第一目的是提供一种crrna，可以准确识别家蚕微孢子虫。

2、本发明的第二目的是提供一种基于crispr/cas12a系统的家蚕微孢子虫可视化检测试剂盒。

3、本发明的第三目的是提供一种利用所述基于crispr/cas12a系统的家蚕微孢子虫可视化检测试剂盒检测家蚕微孢子虫的方法。本方法具有准确、高效、低成本、可视化、适用于现场检测的优势，从而在早期阶段控制家蚕病害的发生与蔓延。

4、技术方案：本发明提供了一种crrna，所述crrna识别的靶点序列为家蚕微孢子虫小亚基rrna基因nbssu的第61bp～第83bp位点的核苷酸序列；所述第61bp～第83bp位点的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述基因nbssu的gene id为ay259631.1。

5、本发明还提供了扩增所述的crrna的引物对，所述crrna的引物对序列如seqidno.3和seq id no.4所示。

6、本发明还提供了一种基于crispr/cas12a系统的家蚕微孢子虫可视化检测试剂盒，包括所述的crrna、ascas12a和ssdna报告分子。

7、优选的，所述基于crispr/cas12a系统的家蚕微孢子虫可视化检测试剂盒包括0.1m～0.2m l-的脯氨酸、体积百分比为1％～10％的甘油。

8、优选的，所述ssdna报告分子为nbssu-61-fd，序列为5’-fam-ttatt-iabkfq-3’；或者为nbssu-61-id，序列为5’-fam-ttatt-biotin-3’。

9、本发明还提供了一种家蚕微孢子虫的荧光检测方法，包括以下步骤：

10、(1)从待测样本家蚕中提取基因组dna；

11、(2)将步骤(1)所述的基因组dna，利用rpa特异性引物扩增获得特异性产物；

12、(3)将步骤(2)所述特异性产物与所述的试剂盒中的试剂反应，其中ssdna报告分子为nbssu-61-fd，序列为5’-fam-ttatt-iabkfq-3’，；

13、(4)利用酶标仪检测样品中家蚕微孢子虫核酸，当出现荧光反应即可判断家蚕感染微孢子虫。

14、本发明还提供了一种家蚕微孢子虫的免疫层析检测方法，包括以下步骤：

15、(1)从待测样本家蚕中提取基因组dna；

16、(2)将步骤(1)所述的基因组dna，利用rpa特异性引物扩增获得特异性产物；

17、(3)将步骤(2)所述特异性产物与所述的基于crispr/cas12a系统的家蚕微孢子虫可视化检测试剂盒中的试剂反应；其中ssdna报告分子为nbssu-61-id，序列为5’-fam-ttatt-biotin-3’；

18、(4)利用免疫层析试纸条检测样品中家蚕微孢子虫核酸，当试纸条上检测线出现条带即可判断家蚕感染微孢子虫。

19、优选的，所述荧光检测方法的rpa引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示，ascas12a添加量为5～25nm，crrna添加量为1～6nm，nbssu-61-fd添加量为5～25nm。

20、优选的，所述免疫层析检测方法的rpa引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示，ascas12a添加量为50～200nm，crrna添加量为25～300nm，nbssu-61-fd添加量为200～400nm。

21、crispr/cas12a荧光检测方法的结果判断：利用酶标仪检测样品均进行三个生物学重复，每个时间点所测得的三个荧光值取平均后制作检测曲线。若检测曲线趋势平直，且曲线每个荧光数值较该曲线荧光总值的平均相差较小(即上下浮动约2000)，则为阴性。此外，将样品及对应阴性对照三次生物学重复所测得的荧光值分别相加取平均并进行显著性t检验，若p值小于0.05，则代表检测结果为阳性，反之为阴性。

22、crispr/cas12a免疫层析检测方法的结果判断：milenia hybridetect 1dipstick免疫层析试纸条具有两条指示线，即质控线(c线)和检测线(t线)。利用试纸条检测样品均进行三个生物学重复。当试纸条t线处存在有色产物形成时，指示靶标dna的存在，此时检测结果为阳性，反之为阴性。

23、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)灵敏度高：可在家蚕幼虫样品中特异性检测家蚕微孢子，灵敏度不低于2copies/μl。现有的核酸检测标准《ny/t3677-2020家蚕微孢子虫荧光定量pcr检测方法》，其检测灵敏度在104copies/μl，本方法灵敏度可提高5000倍；(2)效率高：lamp、定量pcr技术除核酸提取环节外，扩增耗时需40min以上。本发明提供的基于crispr/cas12a系统的家蚕微孢子虫免疫层析检测技术rpa扩增15min，crispr检测15～25min，孵育5min，总耗时35～45min，缩短了检测时间；(3)成本低：本方法无需荧光定量pcr仪、lamp扩增专用设备等，一台普通的恒温设备即可满足检测要求；(4)可视化：本方法最终检测结果除可通过酶标仪等具备检测荧光值变化的生物学仪器进行结果分析以外，还可用肉眼直接通过读取试纸条的条带来判断，无需特殊设备或专业技术人员通过电泳等技术手段判断，检测人员经简单培训即可上岗。