一种腺相关病毒载体及其构建方法与应用与流程

本发明属于生物，特别是涉及一种腺相关病毒载体及其构建方法与应用。

背景技术：

1、大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa, eb) 是一组单基因遗传性皮肤病，呈常染色体显性(ad)或隐性(ar)遗传，特征为皮肤和黏膜受轻微机械性损伤后或自动形成大疱或血疱。通常出生时即发病。营养不良型大疱性表皮松解症(deb)会形成瘢痕，水疱位于皮肤的深层组织，真皮上层的致密板下。deb分为显性遗传(ddeb)和隐性遗传(rdeb)两大亚型。隐性遗传性营养不良型大疱性表皮松解症(recessive dystrophic epidermolysisbullosa, rdeb)是eb最严重的类型。据权威团队最新测算，rdeb全世界的发病率大约1/11000，患病率大约1/85000。

2、rdeb是由编码ⅶ型胶原α-1链的 col7a1基因发生突变导致缺少有功能的vii型胶原蛋白(type vii collagen, c7)所致。c7是位于表皮基底膜带(basementmembrane zone,bmz)致密层下的锚原纤维(anchoring fibril, af)的主要组成成分。c7缺失无法形成正常的锚原纤维，从而使基底膜致密层与网状层连接异常，最终导致表皮与真皮分离，使皮肤脆弱。编码c7的col7a1基因位于染色体3p21.31，跨越大约31kb，含复杂内含子和118个外显子，编码区有8835bp编码2944个氨基酸。col7a1基因上没有突变热点，至2019年已鉴定出800个以上的突变位点，几乎每一个rdeb家庭都有自己独特的突变位点和类型。rdeb的严重程度和col7a1的突变类型有一定的关系，通常无义突变和移码突变更严重，错义突变或不移码的剪接位点突变症状较轻。

3、机械力和轻微创伤就能引起rdeb患者真皮表皮碎裂或脱离，引起皮肤出现水疱及血疱，伤口愈合缓慢，皮肤损伤愈合后可形成瘢痕以及容易反复损伤，形成慢性、疼痛和无法治愈的伤口，长时间可导致皮肤感染、瘢痕及挛缩。几乎每个重型rdeb患者都有并指/趾畸形，获得性并指常导致手足部出现“拳击手套”样畸形。瘢痕从近端发展，进而累及整个肢体，形成弯曲挛缩。可累及甲、齿和头皮。40岁以上患者80%会得鳞状细胞癌，大部分癌变者在首次诊断后5年内死亡。除了明显的皮肤症状，严重的rdeb患者还会出现重症贫血、发育停滞、生长迟缓、严重的黏膜损伤、眼部病变(角膜糜烂和疤痕)、食道狭窄和蹼化、尿道和肛门狭窄等。

4、虽然rdeb发病机理目前已经研究清楚，对致病基因的检测也已经发展到商业化，但是对这种遗传疾病目前尚无有效治疗方法。支持性缓和治疗是目前唯一的治疗手段，尽量提高患者生活质量，但效果有限，仍难以避免皮肤感染、癌变的发。患者每日严重的生理痛苦时刻相伴；终生需要创伤护理，仅敷料花费每年近十万元人民币，以及必要的并发症治疗及手术费用；疾病不仅严重干扰日常生活，对就业也造成极大障碍；此外大面积及反复的皮损对外观的损毁，同时给患者带来很大心理影响。rdeb给患者本人及家庭带来沉重的生理、心理和经济负担，因此有非常迫切的治疗需求。

5、基因治疗有望成为rdeb的有效治疗措施。目前基因治疗主要使用病毒载体进行离体(ex vivo)基因治疗和在体(in vivo)基因治疗。前者收集患者细胞、进行基因工程改造后，再回输到患者体内受体，这使得毒性问题，包括对病毒抗原的免疫反应和对生物分布的担心被规避，常用慢病毒载体(lentiviralvector, lv)和“γ-反转录病毒载体(gamma-retroviral vector，rv)作为基因递送系统。后者将非整合载体直接注射给患者，将功能性矫正基因递送至患者体内，常使用腺相关病毒载体(aav)。

6、近些年，国际上开展的rdeb基因治疗临床试验主要采用基因添加进行离体(exvivo)基因治疗的方式。由于c7蛋白主要由表皮角朊细胞(keratinocyte)合成，真皮成纤维细胞合成一部分[19]，因此rdeb基因治疗靶细胞包括真皮成纤维细胞和表皮角朊细胞。现有的rdeb基因治疗临床试验主要有两种策略：rv介导的自体表皮角朊细胞离体基因添加的表皮片移植疗法和lv介导的自体真皮成纤维细胞离体基因添加的皮下注射疗法。

7、目前，现有技术中关于rdeb的基因治疗主要技术策略及进展如下表1所示。

8、表1.相关研究的主要策略和进展

9、

10、第一种策略利用lv载体携带 col7a1基因，体外修饰患者真皮成纤维细胞，皮下注射细胞到真皮层，其中最有代表性的是美国的fxc-007注射治疗，已启动iii期临床试验(nct04213261)。第二种策略利用rv携带 col7a1基因，体外修饰患者表皮角朊细胞，经扩增和表皮片形成，移植回患处，实现皮肤的结构和功能正常化，其中最有代表性的是美国的eb-101移植治疗。但目前研究显示，这两种方法的安全性和有效性均有不足。rv整合入基因组时易引起插入突变，即“基因组毒性”(genotoxicity)，甚至致癌，而且 rv对非分裂期细胞感染效率低。而慢病毒因为也属于逆转录病毒，所以也存在因为随机插入造成基因组毒性的风险。

11、更重要的是，rdeb不是单纯的皮肤疾病，多组织、器官受累，并且严重影响患者寿命，而上述治疗策略都是只针对皮肤损伤症状，需要能系统性、根本性治疗的策略。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于，克服现有的技术中存在的缺陷，而提供一种腺相关病毒载体及其构建方法与应用。本发明可实现基因的原位修复，有效解决逆转录病毒和慢病毒疗法所出现的基因组毒性的问题，以及只能治疗皮肤症状的不足，提高基因治疗的安全性和有效性。

2、本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

3、本发明的一个方面提供了一种腺相关病毒载体，将col7a1蛋白编码基因部分序列重组至ssaav-dj载体得到所述腺相关病毒载体；所述腺相关病毒载体为aav9-c7-4k，其包括ssaav-dj载体骨架和col7a1蛋白编码基因同源臂，所述ssaav-dj载体骨架序列如seq idno:1所示，所述col7a1蛋白编码基因同源臂序列如seq id no:2所示。

4、优选地，所述载体由限制性内切酶noti单酶切的ssaav-dj载体与col7a1蛋白编码基因部分序列连接转化后构建而成。

5、本发明的另一个方面还提供了一种腺相关病毒载体的构建方法，包括如下步骤：

6、（1）设计引物

7、col7a1蛋白编码基因的引物序列如下：

8、f: ataagaatgcggccgccagaggtggtggagaaatgc

9、r: ataagaatgcggccgcatgaaggatgggtgcacaga；

10、在引物的5’端和3’端分别加上保护碱基和noti酶切位点，将扩增得到的pcr片段利用noti于37±0.5℃进行单酶切1±0.2 h，琼脂糖电泳后切胶回收 col7a1基因片段；

11、（2）将ssaav-dj质粒用限制性内切酶noti于37±0.5℃进行单酶切1±0.2 h，琼脂糖电泳后切胶回收ssaav-dj载体片段；

12、（3）将胶回收试剂盒回收的ssaav-dj载体片段和4kb长度 col7a1基因片段，采用t4dna连接酶连接，室温反应10-20min；

13、（4）取上述连接产物转化感受态细胞，轻轻混匀，冰浴25-35min；42±0.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的lb 培养液37±0.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的lb 琼脂平板上，37±0.5℃倒置培养12-16h；

14、（5）挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素lb 液体培养液中，37±0.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取paav-c7-4k质粒，以noti单酶切初步鉴定后进行dna测序鉴定，至此aav9-c7-4k病毒载体质粒paav-c7-4k构建成功。

15、优选地，所述感受态细胞为stbl3感受态细胞。

16、本发明的又一个方面还提供了一种腺相关病毒，由上述的腺相关病毒载体质粒和包装辅助质粒共转染293细胞制备得到。

17、优选地，所述包装辅助质粒包括phelper质粒和paav-rc9质粒。

18、优选地，转染293细胞所用的转染试剂为pei。

19、本发明的再一个方面还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的腺相关病毒载体和/或上述的腺相关病毒。

20、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

21、本发明的又一个方面还提供了一种上述的腺相关病毒载体、上述的腺相关病毒或上述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备治疗隐性遗传性营养不良型大疱性表皮松解症的基因治疗药物中的应用。

22、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：设计构造了携带目的基因突变位点两侧同源序列的腺相关病毒载体，利用aav 单链dna介导高效同源重组，在体( in vivo)原位修复突变基因，达到治疗效果。本发明构建的腺相关病毒载体同源臂长，安全性高。经本发明腺相关病毒疗法治疗rdeb小鼠，通过直接静脉注射高纯度的aav病毒，治疗后的rdeb小鼠表现出系统性改善，其生存期显著延长。

23、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

24、本发明的具体实施方法及其结果分析由以下实施例及其附图详细给出。