一种普鲁宁的制备工艺的制作方法

1.本发明涉及生物合成领域，具体为一种普鲁宁的制备工艺。


背景技术：

2.普鲁宁是一种二氢黄酮类化合物，最初由民间药物山桃中提取得到的，其在自然界中主要分布于苏木科、蔷薇科、大戟科等植物中。普鲁宁对组织细胞具有保护作用，可以调节血糖平衡，抑制癌细胞，也可作为药物原材料，用来合成各种化学医用药物，如用于合成毛细管扩展的药物等，可以被人体很好的吸收。普鲁宁在食品、药品等领域具有很好的应用前景。
3.由于普鲁宁在自然界中含量少且提取率低，因此国内外主要采用化学法和酶法来制备。相对于化学法反应条件苛刻、产物分离繁琐且对环境危害大的缺点，酶法制备普鲁宁具有反应稳定，安全可靠，便于实施等优点，因而具有更好的应用价值。
4.但现有普鲁宁的酶法工艺中，底物与酶直接接触得到的产物收率还不够好，常需要使用较多的酶量，成本较高，为增大酶与底物的接触机会来提高底物的转化率或增加产物的生成量，目前常用有机溶剂来改变酶催化反应的介质，但有机溶剂酶催化反应缺点多，能直接或间接地与底物或产物发生作用并改变酶蛋白质分子的结构，破坏酶的催化活性，降低酶的稳定性；有机溶剂使后期的分离纯化比较困难，且易造成环境污染。


技术实现要素：

5.本发明为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种普鲁宁的制备工艺，使用柚皮苷作为底物，在其酶解的过程中加入二硫苏糖醇，以催化底物与酶的反应，有效缩短酶解时长，提高普鲁宁的转化率和生成量，制备过程不需要有机溶剂，也不需要进行纯化富集，整个工艺绿色环保，适合工业化生产。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供一种普鲁宁的制备工艺，包括以下步骤：
8.s1、将柚皮苷溶解于水中，得到柚皮苷底物溶液；
9.s2、向所述柚皮苷底物溶液中加入鼠李糖苷酶和二硫苏糖醇，在酸性环境下进行酶解，得到酶解产物；
10.s3、将所述酶解产物进行过滤、洗涤和干燥，即得普鲁宁产品。
11.优选的，所述s1中，所述柚皮苷和水的质量体积比为1:8。
12.优选的，所述柚皮苷、二硫苏糖醇和鼠李糖苷酶的质量比为30：(0.1～0.2)：(0.9～1.5)。
13.更为优选的，所述柚皮苷、二硫苏糖醇和鼠李糖苷酶的质量比为30：0.15：1.5。
14.优选的，所述s2中，所述酸性环境的ph值为5.0～6.8。
15.更为优选的，所述s2中，所述酸性环境的ph值为6.0。
16.优选的，所述ph值的调节剂为碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液或盐酸溶液。
17.优选的，所述s2中，酶解温度为45～55℃。
18.更为优选的，所述s2中，酶解温度为50℃。
19.优选的，所述s2中判定酶解到达终点的条件为：采用薄层层析检测底物，底物斑点消失即为终点；所述薄层层析检测的条件为：薄层板：g254；层析液：乙酸乙酯：甲醇：水＝9：3：2。
20.优选的，所述s2还包括，在酶解过程中加入葡萄糖苷酶和过氧化氢酶。
21.优选的，所述葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的质量比为(1.5～4)：1。
22.优选的，所述柚皮苷的质量与葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶总质量的质量比为30：(0.5～1)。
23.优选的，所述鼠李糖苷酶的质量与葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶总质量的质量比为1.5：(0.5～1)。
24.优选的，所述二硫苏糖醇的质量与葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶总质量的质量比为0.15：(0.5～1)。
25.优选的，所述洗涤为用水洗涤；具体地，为纯化水洗涤，
26.优选的，所述干燥为70～90℃下干燥20～30h。
27.本发明的有益效果是：
28.本发明的普鲁宁制备工艺，先将底物柚皮苷溶解于水中，起到分散柚皮苷和后续加入的物质的作用，并且，柚皮苷的溶解量越大与酶接触的几率就越大，后续酶解效率就越高，酶解时间就越短，不需要有机溶剂进行分散，废水非高盐，因此整个工艺简单易行，有利于环保处理，安全性高。在鼠李糖苷酶水解柚皮苷底物的过程中加入了二硫苏糖醇，一方面，二硫苏糖醇具有还原性，能保护蛋白质的活性，进而能够保证鼠李糖苷酶的蛋白质分子结构不被破坏，一直发挥催化活性，保持了酶的稳定性；另一方面，二硫苏糖醇可以显正电性，且分子较小，能自由通过酶和底物以催化中心微观结构，诱导底物分子与酶的催化中心谷氨酸(glu)结合，加快酶解速度，提高酶解效率，促进酶解正反应，使得普鲁宁的收率和纯度都得到提升。不需进行纯化富集，整个工艺绿色环保，适合工业化生产。
29.本发明的二硫苏糖醇在酸性溶液中可以展现较好的正电性，进而促进与酶的催化过程，在本发明限定的ph和温度条件下，能更好的发挥酶的酶解作用和二硫苏糖醇对酶的作用。
30.为进一步促进酶解正反应，缩短酶解时间，提高酶解效率，本发明在酶解过程中还可以加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，消耗酶解反应过程中产生的葡萄糖和过氧化氢，以促进酶解反应往正向进行，进而促进酶解的效率，减少了酶的使用量，节省了企业生产成本。
31.本发明的制备工艺酶解时间短，酶解效率高，使用少量的酶即可得到高纯度和高收率的普鲁宁产品，极大的节约了生产成本，且制备过程不需要缓冲液，不需要有机溶剂溶解，也不需要有机溶媒纯化富集，生产工艺简单，绿色环保。
附图说明
32.图1为实施例1制备得到的普鲁宁的色谱图；
33.图2为实施例2制备得到的普鲁宁的色谱图；
34.图3为实施例3制备得到的普鲁宁的色谱图；
35.图4为对比例1制备得到的普鲁宁的色谱图；
36.图5为实施例4制备得到的普鲁宁的色谱图；
37.图6为实施例5制备得到的普鲁宁的色谱图；
38.图7为实施例6制备得到的普鲁宁的色谱图；
39.图8为实施例7制备得到的普鲁宁的色谱图；
40.图9为实施例8制备得到的普鲁宁的色谱图；
41.图10为实施例9制备得到的普鲁宁的色谱图；
42.图11为实施例10制备得到的普鲁宁的色谱图；
43.图12为实施例11制备得到的普鲁宁的色谱图；
44.图13为实施例12制备得到的普鲁宁的色谱图；
45.图14为实施例13制备得到的普鲁宁的色谱图。
具体实施方式
46.为了使本领域的技术人员更好地理解发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
47.为提供一种能促进底物与酶的反应，同时不改变蛋白质活性，以缩短酶解时间，改善酶解效率，提高普鲁宁的转化率和生成量的方法，本发明提出一种普鲁宁的制备工艺，包括以下步骤：
48.s1、将柚皮苷溶解于水中，得到柚皮苷底物溶液；
49.s2、向所述柚皮苷底物溶液中加入鼠李糖苷酶和二硫苏糖醇，在酸性环境下进行酶解，得到酶解产物；
50.s3、将所述酶解产物进行过滤、洗涤和干燥，即得普鲁宁产品。
51.具体地，本发明先将底物柚皮苷溶解于水中，起到分散柚皮苷和后续加入的物质的作用，并且，柚皮苷的溶解量越大与酶接触的几率就越大，后续酶解效率就越高，酶解时间就越短。在本发明的实施例中，所述柚皮苷和水的质量体积比为1:8。本发明不需要有机溶剂进行分散，废水非高盐，因此整个工艺简单易行，有利于环保处理，安全性高。
52.继续地，在鼠李糖苷酶的作用下柚皮苷可以脱去一个l-鼠李糖基生成普鲁宁。
53.在酸性环境下，本发明在鼠李糖苷酶水解柚皮苷底物的过程中加入了二硫苏糖醇，一方面，二硫苏糖醇具有还原性，能保护蛋白质的活性，进而能够保证鼠李糖苷酶的蛋白质分子结构不被破坏，一直发挥催化活性，保持了酶的稳定性；另一方面，二硫苏糖醇可以显正电性，且分子较小，能自由通过酶和底物以催化中心微观结构，诱导底物分子与酶的催化中心谷氨酸(glu)结合，加快酶解速度，提高酶解效率，促进酶解正反应，使得普鲁宁的收率和纯度都得到提升。
54.在本发明的一些实施例中，所述柚皮苷、二硫苏糖醇和鼠李糖苷酶的质量比为30：(0.1～0.2)：(0.9～1.5)。进一步地，所述柚皮苷、二硫苏糖醇和鼠李糖苷酶的质量比为30：0.15：1.5。
55.在本发明的一些实施例中，所述酸性环境的ph值为5.0～6.8。进一步地，所述酸性环境的ph值为6.0。二硫苏糖醇在酸性溶液中可以展现较好的正电性，进而促进与酶的催化
过程，并且此ph条件下，也能更好的发挥酶的酶解作用，过酸或过碱都会影响酶的活性。本发明中，所述ph值的调节剂可以为碳酸钠、氢氧化钠溶液或盐酸溶液，其中氢氧化钠溶液或盐酸溶液浓度为1％(m/v)。在本发明的实施例中，使用的是碳酸钠调节ph，同使用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节ph得到的效果一致。
56.在本发明的实施例中，所述s2的酶解温度为45～55℃。进一步地，所述酶解温度为50℃。
57.本发明所述s2中判定酶解到达终点的条件为：采用薄层层析检测底物，底物斑点消失即为终点；所述薄层层析检测的条件为：薄层板：g254；层析液：乙酸乙酯：甲醇：水＝9:3:2。即当底物斑点消失就表示酶解完全，停止反应。
58.为进一步促进酶解正反应，缩短酶解时间，提高酶解效率，本发明在酶解过程中还可以加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。可以消耗酶解反应过程中产生的葡萄糖和过氧化氢，以促进酶解反应往正向进行，进而促进酶解的效率，减少了酶的使用量，节省了企业生产成本。
59.在本发明的一些实施例中，所述葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的质量比为(1.5～4)：1。
60.在本发明的一些实施例中，所述柚皮苷的质量与葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶总质量的质量比为30：(0.5～1)。
61.在本发明的一些实施例中，所述鼠李糖苷酶的质量与葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶总质量的质量比为1.5：(0.5～1)。
62.在本发明的一些实施例中，所述二硫苏糖醇的质量与葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶总质量的质量比为0.15：(0.5～1)。
63.本发明过滤后用水对过滤后的产物进行洗涤；具体地，为纯化水洗涤。通过双缩脲法检测固体物蛋白质，结果是无时停止洗涤。
64.本发明所述干燥为70～90℃下干燥20～30h。
65.本发明的制备工艺酶解时间短，酶解效率高，使用少量的酶即可得到高纯度和高收率的普鲁宁产品，极大的节约了生产成本，且制备过程不需要缓冲液，不需要有机溶剂溶解，也不需要有机溶媒纯化富集，生产工艺简单，绿色环保。
66.上述为本发明的详细阐述，下面为本发明实施例。
67.实施例普鲁宁的制备
68.本发明实施例制备普鲁宁的过程为：
69.s1、将柚皮苷溶解于水中，得到柚皮苷底物溶液；
70.s2、向所述柚皮苷底物溶液中加入鼠李糖苷酶和二硫苏糖醇，在酸性环境下进行酶解，控制酶解温度，用碳酸钠溶液调节ph，120转/分下搅拌酶解，用薄层层析检测底物斑点基本消失即为酶解终点(薄层条件：薄层板：g254；层析液：乙酸乙酯：甲醇：水＝9：3：2)，得到酶解产物；
71.s3、将所述酶解产物用布氏漏斗过滤；过滤后的产物用纯化水洗涤(纯化水体积：过滤后的产物质量为5)，通过双缩脲法检测固体物蛋白质，结果显示无时表明全部洗涤干净；80℃干燥24小时，即得普鲁宁产品。
72.普鲁宁产品纯度检测：
73.使用hplc方法，色谱条件为：
74.样品配制：将对照品与供试品分别配制成1mg/ml溶液，使用甲醇溶解。
[0075][0076]
按下表进行梯度洗脱：
[0077]
时间(min)流动相a流动相b流动相c012％19％69％1215％34％51％2035％45％20％2540％45％15％2812％19％69％
[0078]
普鲁宁产品收率测试：
[0079]
收率＝(产品重量/物料投入量)
×
100％
[0080]
对制备过程中的不同参数做单因素考察实验，以筛选能达到本发明技术效果的参数：
[0081]
实施例不同二硫苏糖醇添加量的单因素考察
[0082]
表1.不同二硫苏糖醇添加量的酶解效果测试
[0083][0084]
不同二硫苏糖醇的添加量影响酶解时间以及制备得到的普鲁宁的纯度和收率，说
明加入的二硫苏糖醇可以与鼠李糖苷酶相互作用，促进柚皮苷与酶的催化中心谷氨酸结合，有效促进酶解反应，加快酶解速度，进而提高产物纯度和收率，但加入过多时，也会影响与酶的结合，进而影响酶解效果，但均优于不加二硫苏糖醇的效果。由表1可以看出，在本发明限定范围内的加量，均能有效缩短酶解时间，提高普鲁宁的纯度和收率，其中，当柚皮苷和二硫苏糖醇的质量比为30：0.15时，效果最优，而若不添加二硫苏糖醇，酶解速度则显著下降，且也一定程度影响普鲁宁纯度和收率。
[0085]
实施例不同ph值的单因素考察
[0086]
表2.不同ph值的酶解效果测试
[0087][0088]
由表2可以看出，在酸环境下，二硫苏糖醇可诱导柚皮苷与酶的催化中心谷氨酸结合，加快酶解速度，促进酶解反应，进而提高产物纯度和收率。在本发明ph值限定范围内，均能使二硫苏糖醇和鼠李糖苷酶发挥良好作用，缩短酶解时间，提高纯度和收率，其中当ph值为6时，酶解效果最优，但是超过了本发明限定的ph范围，如溶液环境过酸或过碱，则会直接影响酶解速度和产品纯度及收率。
[0089]
实施例不同酶解温度的单因素考察
[0090]
表3.不同酶解温度的酶解效果测试
[0091][0092]
由表3可以看出，酶解温度对鼠李糖苷酶的酶解反应和二硫苏糖醇与鼠李糖苷酶之间的作用有直接影响，温度太低就会导致较难酶解，而温度太高则影响酶的活性，也降低酶解效果。在本发明限定的温度范围内，都能满足本发明所需的酶解效果，尤其是当酶解温度为50℃的时候，酶解时间最低，纯度和收率最高。
[0093]
实施例不同鼠李糖苷酶加量的单因素考察
[0094]
表4.不同鼠李糖苷酶加量的酶解效果测试
[0095][0096]
由表4可以看出，鼠李糖苷酶的加量越多，酶解速度会越快，酶解时间就越短。在本发明限定的鼠李糖苷酶加量的范围内，随着酶的增多，酶解时间越短，但是产品的纯度和收率差距不大，由于酶的成本较高，综合考虑成本和效果，最优选择柚皮苷和鼠李糖苷酶的质量比为30：1.5的加量。
[0097]
实施例加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的单因素考察
[0098]
在搅拌酶解时加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，加入量见表5。
[0099]
表5.不同葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶添加量的酶解效果测试
[0100][0101]
由表5可以看出，加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶后能有效缩短反应时间，并且制备得到的普鲁宁纯度和收率都较高，当葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加量较多时，因为原料已经基本酶解完全，则不会再进一步缩短酶解时间。
[0102]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。