一种用于检测DBA致病基因集合的试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物医学检测，尤其涉及了一种用于检测dba致病基因集合的试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、diamond blackfan贫血(dba)是继fanconi贫血之后第二常见的先天性骨髓衰竭综合征，其特征是红细胞再生障碍、身体畸形和癌症易感。dba通常发生在婴儿期，大多数患者在一岁内出现临床表现。大约50％的dba患者有身体异常，包括身材矮小、颅面部、骨骼、上肢、心脏系统、泌尿生殖系统缺陷等。此外，dba患者的癌症易感风险增加，46岁时癌症的累积发病率约为20％，远高于正常人群，高风险癌症包括急性髓细胞白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、结肠腺癌、骨肉瘤等。

2、dba患者的临床表现及实验室检查项目尚缺乏特异性。患者有明确的家族史有助于dba的诊断。多数患者发病年龄小于1岁，多数患者存在大细胞性贫血、网织红细胞减少、骨髓中红细胞前体细胞减少、红细胞腺苷脱氨酶活性(ada)升高、血红蛋白f(hbf)持续存在以及身体畸形。然而，鉴于其临床表现的巨大差异，且多数患者为新发变异，无相关阳性家族史，用传统方法诊断dba是一项挑战。而基因突变分析是dba诊断的重要标准，目前可检测出～80％的dba患者。

3、目前检测dba的方法主要涉及血常规、骨髓细胞形态及分子生物学等。其中分子生物学的实验方法主要有巢式pcr、一代测序等。pcr方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。但目前二代测序的方法在dba基因检测的检测并确定致病基因上缺少便捷的检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中dba基因检测的不足和实际需求，本发明提供了一种用于检测dba致病基因集合的试剂盒及检测方法，克服了现有技术中mpn检测方法不能同时检测较多相关的基因突变，对相关基因突变的判断困难的问题。

2、第一方面，本发明提供了一种dba致病基因集合，所述dba致病基因集合包括rpl11、rpl15、rpl26、rpl27、rpl35a、rpl5、rps10、rps17、rps19、rps24、rps26、rps27、rps28、rps29、rps7、tsr2或gata1中的一种或多种突变基因的突变位点。

3、进一步，所述dba致病基因集合包括rpl11、rpl15、rpl26、rpl27、rpl35a、rpl5、rps10、rps17、rps19、rps24、rps26、rps27、rps28、rps29、rps7、tsr2和gata1突变基因的突变位点。

4、进一步，所述突变基因的突变位点如表1所示。

5、表1突变基因的突变位点

6、

7、

8、第二方面，本发明提供了一种用于检测权利要求1所述的dba致病基因集合的引物组合，所述引物组合包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq idno.1-seq id no.89所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.90-seq id no.178所示。

9、进一步，所述引物组合包括分别用于扩增rpl11、rpl15、rpl26、rpl27、rpl35a、rpl5、rps10、rps17、rps19、rps24、rps26、rps27、rps28、rps29、rps7、tsr2和gata1突变基因的突变位点的引物组合a、引物组合b、引物组合c、引物组合d、引物组合e、引物组合f、引物组合g、引物组合h、引物组合i、引物组合j、引物组合k、引物组合l、引物组合m、引物组合n、引物组合o、引物组合p、引物组合q；

10、所述引物组合a中的引物核苷酸序列如表2所示，

11、表2引物组合a中的引物核苷酸序列

12、 基因 引物序列 seq id no rpl11 ctagcactacccacaagggagaa 1 rpl11 ggatggcgacggataaaggaaa 90 rpl11 agcaggatcaaggtgaaaaggag 2 rpl11 cagcaggtaaatcaagaaacaaccaag 91 rpl11 tggatgaatgcttaatgtctctttaagtca 3 rpl11 ctacatgtgttactaaaggagtgctgat 92

13、所述引物组合b中的引物核苷酸序列如表3所示，

14、表3引物组合b中的引物核苷酸序列

15、

16、

17、所述引物组合c中的引物核苷酸序列如表4所示，

18、表4引物组合c中的引物核苷酸序

19、 基因 引物序列 seq id no rpl26 aagaacggatggctgctgatta 18 rpl26 tgacactagccataaatttatttcccagtt 107 rpl26 gtgcgtaaaatatccatcaagacaacg 19 rpl26 ggaagctggatgagattttggtcattta 108 rpl26 tagggagtgtcctaaatcaccaca 20 rpl26 ggctttcccttgtgttttagtgattattta 109 rpl26 gcccttgatttaagaaagcaacagata 21 rpl26 atctttggtaaacttacagaaccggaa 110

20、所述引物组合d中的引物核苷酸序列如表5所示，

21、表5引物组合d中的引物核苷酸序列

22、 基因 引物序列 seq id no rpl27 gctctgggcatctttggcttta 22 rpl27 gaaacaggccttgaattccaagc 111 rpl27 gcctaaataggccctcagtgaa 23 rpl27 attattcaacagagcagggagaagaaat 112 rpl27 ccaaggtcaagtttgaagagaggtaa 24 rpl27 gcccacccagtgtttcctattc 113

23、所述引物组合e中的引物核苷酸序列如表6所示，

24、表6引物组合e中的引物核苷酸序列

25、 基因 引物序列 seq id no rpl35a cgaactcctacatgaaactccca 25 rpl35a ccacccaaaagttactcagagca 114 rpl35a ccactagaacatgtaattggtagcctt 26 rpl35a cccttgtactccaaaaatgctgag 115 rpl35a ggcggagtcgaaagatgtttaatc 27 rpl35a ccaacatctcctccatcctgttc 116

26、所述引物组合f中的引物核苷酸序列如表7所示，

27、表7引物组合f中的引物核苷酸序列

28、 基因 引物序列 seq id no rpl5 gggactgatggcagctactaaa 28 rpl5 gttttaccatgtctggagttacgct 117 rpl5 gaaacctgggattctacaagtgaca 29 rpl5 tgtagaaaggatactccactgcatct 118 rpl5 tgaaaccagcatttacattggtttcttg 30 rpl5 gtccaggcaccaaggtcttaaa 119 rpl5 cctctctctttcacacgtcact 31 rpl5 ctggcatacgggcaagaaaagg 120 rpl5 gacttttggccctatggtagtagg 32 rpl5 tgagctacccgatccttcttct 121 rpl5 tttattttagtaccaaacgattccctggt 33 rpl5 cccaaaacaagtaataaacctatttccataaat 122

29、所述引物组合g中的引物核苷酸序列如表8所，

30、表8引物组合g中的引物核苷酸序列

31、 基因 引物序列 seq id no rps10 cctcgggacttgagagactgtaa 34 rps10 gttcaaggcaagttcaaaaaggga 123 rps10 tcttcttaggcatcaacatctgcaa 35 rps10 gcatgttgtctacggttttgtgtg 124 rps10 ttgacaggacccacccatacta 36 rps10 ggagtggtacttggcttttcctg 125 rps10 gggaagatccctccatcccatt 37 rps10 tcagaagtgctcttgacaatcgt 126 rps10 agccgatggaactcgaacg 38 rps10 agatccgccagttcttcagg 127

32、所述引物组合h中的引物核苷酸序列如表9所示，

33、 基因 引物序列 seq id no rps17 cctttggaagccaagaacccat 39 rps17 gtatttatatatgcacatgtgctcagtacca 128 rps17 cgggtccttggtaaaagaggaa 40 rps17 gcggtcccattaaaaatcagatgg 129 rps17 aaaaacatcaaagtgcaatgaagatactc 41 rps17 gatcatgattcccaaatctagtggctt 130 rps17 gcacctgaatcccagacaagtg 42 rps17 cacagatctcaccagtaactgct 131 rps17 tactagctgggtgaccttggataataa 43 rps17 ctatccttgtgcagctcctctt 132 rps17 agggagtctcaggctaacgaaa 44 rps17 ccgggtcatcatagaaaagtactacac 133 rps17 ccggctaaacagtgccg 45 rps17 agctttaacaggcttcgcct 134

34、表9引物组合h中的引物核苷酸序列

35、所述引物组合i中的引物核苷酸序列如表10所示，

36、表10引物组合i中的引物核苷酸序列

37、 基因 引物序列 seq id no rps19 ctgagaccttgatcaagaccctt 46 rps19 tcaaggctactccatcaatgcag 135 rps19 ggcagccttcctcaaaaagtga 47 rps19 ctgtgcccagagtacaaagagag 136 rps19 ccctaggttccctgtcacagtt 48 rps19 gtttccttctcccggagtgtaa 137 rps19 ggcacagcatagttgtgttgag 49 rps19 cagaggagacagggaagtatggt 138 rps19 gaaaaggaccaagatgggtaagca 50 rps19 tgctgtttgcttttctgcagaatc 139

38、所述引物组合j中的引物核苷酸序列如表11所示，

39、表11引物组合j中的引物核苷酸序列

40、

41、

42、所述引物组合k中的引物核苷酸序列如表12所示，

43、表12引物组合k中的引物核苷酸序列

44、 基因 引物序列 seq id no rps26 aggatggtggtcaagttctttgg 60 rps26 ccatgaaaataatgtgtgtcacttcaca 149 rps26 cgccgttttcctaacagttttcc 61 rps26 gctttaagatactgggatcctcaca 150 rps26 gcgtataccggaaaactgcatc 62 rps26 caccgggagaatccttaggaga 151

45、所述引物组合l中的引物核苷酸序列如表13所示，

46、表13引物组合l中的引物核苷酸序列

47、 基因 引物序列 seq id no rps27 tggatgatgagttgggcataagtg 63 rps27 tcactgttaagaccgaaaaatcctaagaaa 152 rps27 gggctattttcgaccatcccat 64 rps27 cagctaacactacaacattttccaactg 153

48、所述引物组合m中的引物核苷酸序列如表14所示，

49、表14引物组合m中的引物核苷酸序列

50、 基因 引物序列 seq id no rps28 ggcagagtctacatacagagactga 65 rps28 gccactcaagaaacctggagaaa 154 rps28 gcggtgctagaacgtcctataa 66 rps28 cttggtgacctggaggaaagaag 155

51、所述引物组合n中的引物核苷酸序列如表15所示，

52、表15引物组合n中的引物核苷酸序列

53、 基因 引物序列 seq id no rps29 tcagaattaccactccagggaaga 67 rps29 gtctgagtgcggagtcttgtaa 156 rps29 gaagttgcagagagctgagct 68 rps29 ctgtaaaaacaaaaacaacaaaaaccagagacc 157 rps29 caggaggcttgaacctaggttg 69 rps29 gggcatctactcaatgaaaaaccatgata 158 rps29 cctagcagaggttatgcaagca 70 rps29 ggaaatgaggaagacatgaaagcaga 159 rps29 cattagccacacgaacaactgt 71 rps29 gcaacaaatcttactgtgttgagatcact 160 rps29 cgtggcctcctctacttgagat 72 rps29 cgtttcctttgagcactgcattc 161

54、所述引物组合o中的引物核苷酸序列如表16所示，

55、表16引物组合o中的引物核苷酸序列

56、 基因 引物序列 seq id no rps7 gggcacaatttcacgaaactattagg 73 rps7 cacacaggacgccactgataat 162 rps7 gaccacaacgtttactttctgaagc 74 rps7 aatgcagtctaaatacaagcaattttagca 163 rps7 aaagcgttaccaagacactcgt 75 rps7 cctgactccaaaaggcgttttc 164 rps7 cctgctctccgacagaactttt 76 rps7 gctttctcctgggagaactgaa 165 rps7 gtcggtcctgctgttcgt 77 rps7 ggcaagtcatcatcaaccgtaac 166

57、所述引物组合p中的引物核苷酸序列如表17所示，

58、表17

59、

60、

61、所述引物组合q中的引物核苷酸序列如表18所示。

62、表18引物组合q中的引物核苷酸序列

63、 基因 引物序列 seq id no gata1 ttctgtcctcgcaggttaatcc 83 gata1 acagccactcaatggagttacc 172 gata1 gcgctgaccctagactgatttt 84 gata1 ctctgtcttcaaagtctccaggaa 173 gata1 ggtggtgtccttctcctcttgta 85 gata1 ggcattgttacacactccactca 174 gata1 acaggccactacctatgcaac 86 gata1 gggaagatgtggcttcttgtacag 175 gata1 gtgtcctccacaccagaatcag 87 gata1 ggtattctgacctagccaaggatct 176 gata1 cctatcagccttggaggctttc 88 gata1 tctttttcccttttccagatgcctt 177 gata1 ggtactgcccatctctaccaag 89 gata1 cagagacttgggttgtccagaa 178

64、第三方面，本发明提供了一种用于检测dba致病基因集合的试剂盒，所述试剂盒包括用于提取样本全基因组dna的试剂、复合扩增体系和构建dna文库试剂。

65、进一步，所述复合扩增体系包括所述引物组合中的引物和扩增预混液，所述引物组合中的引物工作浓度均为0.1μm。

66、第四方面，本发明提供了一种用于检测dba致病基因集合的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

67、s1、提取样本全基因组dna；

68、s2、扩增dba致病基因的目标序列；

69、s3、构建dna文库；

70、s4、上机测序，获得原始测序信号文件；

71、s5、对原始测序信号文件进行生物学分析。

72、进一步，所述步骤s5中的生物学分析包括变异检测注释，所述变异检测注释的内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白水平变异中的一种或多种。

73、本发明的优点在于：

74、1)本发明提供了一种用于检测dba致病基因集合的引物组合物，通过设定致病突变位点的筛选方法得到全面的dba致病基因集合，针对突变基因的特点设计引物组合，具有覆盖面广，检测效率高的优点，实现了利用高通量测序技术在骨髓形态学和血常规检查之外对dba进行辅助检测，准确的确定dba致病的基因型，对于指导疾病后续的治疗方向具有明显的优势，弥补了临床dba在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。

75、2)本发明提供了一种用于检测dba致病基因集合的试剂盒及检测方法具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高等优点，解决了目前监测准确性低，检测方法局限的技术缺陷。