一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株、构建方法及其应用

本发明属于生物，涉及构建基因工程菌株，尤其是一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株、构建方法及其应用。

背景技术：

1、ε-聚赖氨酸(ε-polylysine，ε-pl)是天然氨基酸同聚物，属于一种碱性聚酰胺，由25-35个l-赖氨酸残基通过ε-氨基和α-羧基形成酰胺键连接而成。因其具有热稳定性强及水溶性好、抑菌谱广和安全性高等优势，在食品、材料、医学等多个领域均有广泛的应用前景。

2、近些年，随着对于ε-聚赖氨酸应用潜能的挖掘，市场对于ε-聚赖氨酸的需求也在逐渐增大。但目前国内关于ε-聚赖氨酸生产方面的研究起步较晚，主要停留在ε-聚赖氨酸生产工艺的优化和ε-聚赖氨酸生产菌株的选育两个方面。如任喜东等建立了一种ph冲击策略发酵生产ε-聚赖氨酸，通过在发酵前期将ph控制在5.0，随后ph自然下降12h至ph 3.0左右后回调ph值为4.0左右的策略使得ε-聚赖氨酸产量达到54.7g/l(任喜东.小白链霉菌响应酸性ph高产ε-聚赖氨酸的生理解析[d].江南大学,2015.)；席志文等则通过artp和des复合诱变的手段筛得了一株诱变高产菌株streptomyces albulus ad-9，在摇瓶发酵水平ad-9较出发菌株的ε-聚赖氨酸产量提高了2.1倍(席志文,黄林娜,翟一畅,惠丰立.artp-des连续诱变选育高产ε-聚赖氨酸突变株[j].食品科学,2020,41(14):131-137.)。其中，发酵工艺的优化虽提高了ε-聚赖氨酸的生产水平，但并未提高菌株自身的ε-聚赖氨酸合成能力，诱变育种则又存在着偶然性强、工作量大等问题。而对于ε-聚赖氨酸生产菌株代谢途径的定向改造则可在提高ε-聚赖氨酸生产能力的同时，又降低实验盲目性。但目前关于构建定向改造工程菌株提高ε-聚赖氨酸产量的研究则相对较少，尤其是未发现通过过表达dap途径中关键酶提高ε-聚赖氨酸产量的相关报道。

3、通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的公开文献：

4、1、一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用(cn 105441373 a，申请日2015.12.4)，公开了一种小白链霉菌基因工程菌streptomyces albulus pd-4，它是将来源于s.albulus pd-1基因组上的铵转运蛋白基因amtb进行过量表达，通过提高氮源供给提高ε-聚赖氨酸发酵水平。

5、2、一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法(cn 110804572a，申请日2019.12.4)，公开了一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法，属于微生物发酵领域。它是通过对小白链霉菌(streptomyces albulus)m-z18进行浓度梯度的抗性筛选而产生的基因组重排菌株，发酵192h产量可达到56.3g/l，但基因组重排方法选育高产菌株存在工作量大，不确定性强的缺点。

6、通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献在工程菌株构建策略上有本质上的不同。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株、构建方法及其应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种高产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的基因工程菌株，所述基因工程菌株是以产ε-聚赖氨酸链霉菌为底盘菌株，并进行如下之一改造：

4、a)过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapf；

5、b)过表达二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysa。

6、进一步地，过表达的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapf基因核苷酸序列与seqid no.1具有84.4％及以上的一致性；

7、过表达的二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysa的核苷酸序列与序列seq id no.3至少有83.8％以上的一致性；

8、或者，过表达的基因dape、lysa是通过pcr技术扩增的，或者是直接合成的。

9、进一步地，所述底盘菌株为产ε-聚赖氨酸的链霉菌属菌株，包括小白链霉菌streptomyces albulus、淀粉酶产色链霉菌streptomyces diastatochromogenes、灰褐链霉菌streptomycesgriseofuscus、不吸水链霉菌streptomyces ahygroscopicus。

10、进一步地，优选底盘菌株为小白链霉菌streptomyces albulus tust2或淀粉酶产色链霉菌streptomyces diastatochromogenes 6#-7；

11、其中，streptomyces albulus tust2的保藏编号为cgmcc no.1986，保藏日期为2007年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

12、streptomyces diastatochromogenes 6#-7的保藏编号为cgmcc no.22261，保藏日期为2021年4月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

13、如上所述的基因工程菌株的构建方法，所述方法采用的底盘为产生ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的链霉菌，过表达的是底盘菌株内源或外源的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapf或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysa中的一个。

14、进一步地，所述方法在构建中使用的过表达质粒是带有强启动子红霉素启动子erme*的质粒pimep。

15、进一步地，所述方法包括如下步骤：

16、(1)目的片段基因的获得：

17、根据二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapf设计上下游引物序列dapf-f/dapf-r，即seq idno.5/seq id no.6，以提取的s.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板，pcr扩扩增出带有同源臂dapf基因，全长879bp，dapf基因序列为seq id no.1，或者根据外源龟裂链霉菌(streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯差向异构酶dapf基因序列即seq idno.2直接合成；

18、根据二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysa设计上下游引物序列lysa-f/lysa-r即seqid no.7/seq idno.8为上下游引物，以提取的s.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板，pcr扩增内源目的基因lysa，全长1143bp，lysa基因序列为序列seq id no.3，或者根据外源龟裂链霉菌(streptomyces rimosus)二氨基庚二酸酯脱羧酶lysa基因序列即seq idno.4直接合成。

19、(2)重组质粒的构建：

20、将pcr扩增的或者直接合成的dapf或lysa基因片段与带有红霉素强启动子erme*的线性质粒pimep进行连接，得到连接产物重组质粒pimep：：dapf或pimep：：lysa，利用化学法将构建好的重组载体转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞，并通过安普霉素抗性筛选大肠杆菌dh5α阳性转化子，培养大肠杆菌dh5α阳性转化子，提取转化子中的重组质粒pimep：：dapf或pimep：：lysa，备用；

21、(3)工程菌株构建

22、重组质粒pimep：：dapf或pimep：：lysa分别转化至大肠杆菌et12567(puz8002)中，涂布于含有12.5-25μg/ml卡那霉素、25-50μg/ml安普霉素和12.5-25μg/ml氯霉素的lb平板中，挑选大肠杆菌et12567(puz8002)阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的lb液体培养基中，37℃恒温振荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜lb液体培养基中，37℃振荡培养至od600至0.4～0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的lb液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至lb液体培养基中置于冰上备用；向贝纳特培养基上培养好的底盘菌株平板上加入ph 8.0的tes缓冲液，刮下链霉菌底盘菌株孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180-200r/min振荡打断孢子链，过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温后加入m3g培养基，于37℃条件下振荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集萌发孢子，用tes缓冲液重悬萌发孢子备用；

23、将制备的大肠杆菌et12567(puz8002)阳性转化子细胞和萌发的链霉菌底盘菌株孢子分别等体积混合，均匀涂布于含有5mm mgcl2的sfm培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/ml的萘啶酮酸及浓度为25mg/ml的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养。

24、进一步地，每1l m3g培养基的组成为：

25、(nh4)2so410 g，kh2po41.36 g，k2hpo40.8 g，酵母提取物5g，用氨水调节ph到7.2，用蒸馏水定容到900ml后121℃单独灭菌20min，每100ml m3g培养基使用前再添加10ml 10×葡萄糖母液；10×葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml20 g/l znso4·7h2o和2ml 10g/lmgso4·7h2o，用去蒸馏水定容至100ml后115℃单独灭菌30min。

26、或者，每1l贝纳特培养基的组成为：

27、葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，加水补充至1l，naoh调ph至7.7；

28、或者，每1l sfm培养基的组成为：

29、黄豆饼粉30g，甘露醇20g、琼脂粉20g，加水补充至1l，用naoh调节ph 7.2～7.4；

30、其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：

31、加入900ml自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。

32、一种利用如上所述的基因工程菌株发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法，包括如下步骤：

33、将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生孢子；然后，将孢子接种至含葡萄糖的m3g培养基摇瓶中，在28-30℃，180-220r/min，培养30h，将培养好的种子培养液转接到含葡萄糖的m3g培养基中进行发酵罐补料发酵，即获得含ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的发酵液，进而能够采用离心、吸附、洗脱、脱色、干燥进一步纯化即可得到ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐。

34、如上所述的基因工程菌株在发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐方面中的应用。

35、本发明取得的优点和积极效果为：

36、1、本发明通过在产ε-聚赖氨酸链霉菌底盘菌株的基础上进行基因工程高改造，过表达影响ε-聚赖氨酸合成的二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapf或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysa中的一个，获得ε-聚赖氨酸及其盐酸盐高产链霉菌工程菌株并应用高产工程菌株发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐酸盐，显著降低了生产成本，为ε-聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。

37、2、本发明方法通过过表达关键酶二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapf或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysa构建工程菌株s.diastatochromogenes dapf-1或s.diastatochromogenes lysa-1，分批补料发酵生产ε-聚赖氨酸，其ε-聚赖氨酸产量(g/l)分别为出发底盘菌株s.diastatochromogenes 6#-7的127.44％和130.38％；生产强度(g/l·h)分别为出发底盘菌株s.diastatochromogenes 6#-7的119.88％和160.47％；糖酸转化率分别为出发底盘菌株s.diastatochromogenes 6#-7的136.89％和105.51％，显著降低了生产成本，为ε-聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。

38、3、本发明方法通过过表达外源二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapf或二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysa构建的工程菌株s.albulus dapf-2或s.albulus lysa-2，分批补料发酵生产ε-聚赖氨酸，其ε-聚赖氨酸产量(g/l)分别为出发底盘菌株streptomycesalbulus tust2的131.55％和136.38％；生产强度(g/l·h)分别为出发底盘菌株streptomyces albulus tust2的119.93％和159.29％；糖酸转化率分别为出发底盘菌株streptomyces albulus tust2的134.40％和103.93％，显著降低了生产成本，为ε-聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌种。