控制番茄果实成熟时间及采后贮藏硬度的相关Ⅱ型α-甘露糖苷酶基因SlMAN1及应用

本发明属于植物生物技术和基因工程领域，涉及转基因育种领域，具体涉及一种控制番茄果实成熟时间及采后贮藏硬度相关ⅱ型α-甘露糖苷酶基因slman1及应用。

背景技术：

1、番茄(solanum lycopersicum)是世界第四大商业作物，中国是最大的番茄生产国。番茄果实成熟是一个复杂的生理生化过程，包括颜色，味道，质地和香气等众多生理代谢变化。同时番茄属于呼吸跃变型果实，在成熟过程中会快速丧失坚硬的质地，不利于采摘，储存和运输，因此如何解决果实采后软化变质的问题是目前番茄消费行业面临的挑战之一。

2、高等植物细胞壁均由纤维素、半纤维素、果胶和糖蛋白等大分子组成，而果实的软化及质地的损失主要是由于果实细胞壁物质的降解和结构的破坏。在果实成熟衰老过程中，许多细胞壁水解酶如纤维素酶，果胶甲酯酶，多聚半乳糖醛酸酶及各类糖苷水解酶如β-半乳糖苷酶，α-甘露糖苷酶等活性增加，导致果肉软化。

3、糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰类型之一，其中n-糖基化是糖蛋白中最主要的糖基化类型，在蛋白质稳定性、信号传导、细胞生长、蛋白质活性调节等方面起着重要的作用。在番茄果实生长发育的所有阶段，n-聚糖都存在于果皮组织中，并且在果实成熟阶段含量明显增加，说明n-糖基化与果实成熟密切相关。同时游离n-聚糖作为糖基化的前体及n-糖蛋白的水解产物，说明n-聚糖的水平也与果实的成熟过程具有密不可分的关系。

4、番茄是重要经典遗传学和基因组研究的模式植物，在果实发育和成熟相关的研究中，番茄也能为其他结实植物提供参考，但目前国内外关于番茄果实的n-糖基化及n-聚糖相关酶的研究还较少。且在呼吸跃变型和非呼吸跃变型果实成熟期间，n-聚糖加工过程均较为保守；ⅱ型α-甘露糖苷酶是植物体内n-聚糖加工的关键酶，鉴别出参与番茄果实成熟过程的基因α-manⅱ，对于阐明番茄果实成熟机制具有重要意义，为开发新番茄奠定基础，且可用于其他植物基于基因工程技术的果实组分改良，对改变n-聚糖水平，增加食物的贮存和保健功能，有重要的应用价值，为通过糖修饰途径改善呼吸跃变型或非呼吸跃变型果实的贮运性提供新策略。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种控制番茄果实成熟时间及采后贮藏硬度的基因slman1，slman1能够有效影响番茄果实成熟进程，提高果实在采后贮藏过程中的硬度。该基因编码的是ⅱ型α-甘露糖苷酶，属于外切糖苷水解酶之一，是植物体内n-聚糖加工的关键酶，可水解糖蛋白中存在的高甘露糖型和植物复合型n-聚糖末端的α-甘露糖苷键，既是n-聚糖成熟的关键酶，同时也参与n-聚糖的降解。其细胞壁定位和n-聚糖加工能力说明slman1可通过参与细胞壁n-糖蛋白的降解和游离n-聚糖的产生，从而影响果实成熟软化。

2、本发明提供了一种控制番茄果实成熟时间及采后贮藏硬度的基因，所述基因为slman1，包含至少具有下列特征之一的核苷酸序列：

3、1)seq id no.1表示的核苷酸序列；

4、2)编码seq id no.2氨基酸序列的核苷酸序列；

5、3)与seq id no.1的核苷酸序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

6、4)与seq id no.1表示的dna序列杂交的核苷酸序列；

7、5)与seq id no.1编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

8、本发明中所述的控制番茄果实成熟时间及采后贮藏硬度是指两个作用：一是在采前影响番茄果实的成熟进程，即延缓番茄成熟时间；二是在采后影响番茄果实的贮藏硬度，即提高番茄果实的采后贮藏硬度。控制番茄果实成熟时间及采后贮藏硬度也就控制了番茄的成熟软化。

9、所述成熟时间是指通过记录花朵的开放日期，在花后不同天数进行果实转色情况进行拍照记录，同时统计果实破色天数后进行比较。所述的硬度是指采用质构仪对果实进行硬度测量，单位为牛顿(n)。

10、序列seq id no.1所示的核苷酸序列是从番茄果实中提取的，即使对seq id no.1所示的核苷酸序列置换、缺失、插入和/或添加了一个或数个碱基的核苷酸序列，或与seqid no.1的核苷酸序列具有80％以上同源性或85％以上同源性或90％以上同源性或95％以上同源性，只要是编码具有α-甘露糖苷键水解功能蛋白质的核苷酸序列，就包含在本发明涉及的ⅱ型α-甘露糖苷酶基因中。

11、所述的ⅱ型α-甘露糖苷酶基因为slman1。发明人通过系统研究slman1基因的生物学功能，首次验证了slman1在番茄果实中的独特作用。申请人成功在番茄中沉默表达了slman1基因，即slman1的dna序列(参见序列表中的seq id no.1的核苷酸序列)。进一步地，发明人还发现沉默表达slman1基因的番茄果实成熟天数延后，且在采后贮藏过程中的硬度显著增加，影响了番茄果实的成熟软化进程(参见附图6和7)。

12、本发明还提供了一种ⅱ型α-甘露糖苷酶基因slman1编码的多肽或蛋白质，包含至少具有下列特征之一的氨基酸序列：

13、1)seq id no.2表示的氨基酸序列；

14、2)与seq id no.2具有80％以上同源性，且显示α-甘露糖苷键水解功能的多肽或蛋白质的氨基酸序列；

15、3)将序列表中的seq id no.2的氨基酸残基序列经过一个或2个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且显示α-甘露糖苷键水解功能的蛋白质的氨基酸序列。

16、本发明所述的多肽或蛋白质是由所述的slman1基因经细胞内的转录和翻译过程表达而来。所述的转录是指细胞以所述slman1基因的核苷酸为模板，根据核苷酸互补配对原则，以核糖核苷酸为原料，合成对应的slman1 mrna的过程。所述的翻译是指，细胞进一步以所述的slman1 mrna为模板，以氨基酸为原料，合成出对应slman1多肽或蛋白质的过程。

17、本发明还提供了一种ⅱ型α-甘露糖苷酶，包含如前所述氨基酸序列中的至少一种。

18、所述的α-甘露糖苷酶具有水解糖蛋白中存在的高甘露糖型和植物复合型n-聚糖末端的α-甘露糖苷键的功能。优选的，所述的α-甘露糖苷酶为slman1，可催化高甘露糖型和/或n-聚糖末端的α-甘露糖苷键断裂反应。

19、本发明还提供了一种基因编辑载体，所述的基因编辑载体可特异性识别含有如前所述的slman1基因的核苷酸序列或含有如前所述的slman1基因部分的核苷酸序列；进一步，所述载体为pylcrispr/cas9-slman1基因编辑载体，所述载体表达靶向seq id no.1序列核酸分子的sgrna，所述sgrna的序列为t1、t2，所述t1序列为seq id no.1的第801-820位核苷酸，所述t2序列为seq id no.1的第1112-1131位核苷酸；

20、进一步地，所述pylcrispr/cas9-slman1基因编辑载体为利用bsa i限制性内切酶在pylcrispr/cas9-pubi-h的多克隆位点间依次插入atu3d-t1-grna、atu3b-t2-grna得到的重组载体。本发明所述的基因可插入到现有的真核或原核表达载体中，适宜的载体包括细菌质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等。所述的载体是一种环状dna分子，能够在细胞内自主复制和转录表达，是基因工程中最常用的工具之一。

21、本发明还提供了一种转基因细胞系或种子，所述转基因指的是如前所述的slman1基因被敲除；进一步，所述基因敲除指的是敲除seq id no.1第818位和819位碱基造成阅读框发生移码突变，进而沉默slman1基因。所述的转基因细胞系或种子含有如前所述的具有部分slman1核苷酸序列的基因敲除表达载体。本发明所述的含有部分slman1基因片段的载体可以用来转化得到适当细胞系或种子，所述的细胞系来自植物细胞，例如番茄细胞，桃子细胞。进一步，所述转基因细胞为农杆菌gv3101细胞。

22、敲除后的基因序列表现为在slman1基因的t1位点发生2个核苷酸的缺失，即seqid no.1的第818和819位核苷酸gg缺失。

23、进一步，本发明提供了一种控制番茄果实成熟时间及采后贮藏硬度的方法，所述方法是slman1基因敲除/沉默从而致使基因所编码的α-甘露糖苷酶的功能缺失；优选的，所述基因敲除/沉默的目标包括如前所述的核苷酸序列，如前所述的氨基酸序列、如前所述的ⅱ型α-甘露糖苷酶中的至少一种；进一步，所述基因敲除指的是敲除seq id no.1第818位和819位碱基造成阅读框发生移码突变，进而沉默slman1基因。

24、本发明还提供了一种转基因植物，所述植物包含如前所述的转基因细胞系和种子；进一步，所述的植物为番茄；进一步，所述的植物为番茄ailsa craig。

25、进一步的，本发明提供了一种转基因植物的培育方法，所述的培育方法是向受体植物中导入如前所述的特定的基因编辑载体，该载体可与seq id no.1上特定的靶位点结合，并使受体植物沉默表达该核苷酸以获得转基因植物。优选的，所述的植物是番茄。

26、如实施例5和6所述，沉默表达番茄中slman1基因，与野生型番茄相比，沉默表达slman1基因的番茄果实成熟天数延后，采后贮藏硬度显著增加。

27、本发明提供了如前所述转基因细胞系或种子或如前所述的转基因植物的育种方法，在制备耐储运番茄中的应用。

28、本发明提供了如前所述的编码slman1基因的核苷酸序列、如前所述的slman1基因编辑载体、如前所述的转基因细胞系或种子在基因工程育种中的应用。所述的基因工程是指在体外构建含有slman1基因编辑载体，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。所述的基因工程育种的应用包括培育植物新品种、开发食品工业等。

29、本发明提供一种耐储运番茄，所述番茄是指具有沉默表达slman1基因的转基因植物所结的果实，其具有延迟成熟及提高果实采后贮藏硬度的特性。

30、本发明的有益效果：本发明提供了slman1基因在控制番茄果实成熟时间及采后贮藏中的应用。突变slman1基因能够延缓番茄果实成熟，提高番茄在采后贮藏过程中的硬度。说明slman1基因能够有效为番茄果实开展基因工程，及从糖修饰途径改善呼吸跃变型和非呼吸跃变型果实采后贮藏性提供新的候选基因。