检测SARS-CoV-2的引物组、核酸组合产品和试剂盒的制作方法

本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种检测sars-cov-2的lamp引物组、核酸组合产品和试剂盒。

背景技术：

1、新型冠状病毒(sars-cov-2)是一种rna病毒，具有宿主范围广，传播力强，变异率高等特点。

2、针对新型冠状病毒检测主要有抗原检测法和核酸检测法。

3、抗原检测法检测的是人体内是否存在病毒蛋白。抗原检测试剂盒操作简单，通常在15分钟左右就可以显示结果。缺点是由于不能放大病毒抗原，导致抗原检测灵敏性较低，对于处于感染早期的新冠患者可能会出现假阴性的结果。

4、核酸检测法主要为实时荧光pcr检测，实时荧光pcr需要特定的引物、具有荧光团/猝灭剂双标记探针以及具有5'→3'核酸外切酶活性taq dna聚合酶，通过聚合酶链反应(pcr)扩增sars-cov-2的保守片段，探针退火至内部特定序列。引物伸长后，taq dna聚合酶置换并水解探针，从而释放并激活荧光团。反应过程中观察到的荧光增加可检测sars-cov-2的存在，且荧光信号的增加与样品中扩增产物的数量成正比，并由实时荧光pcr仪器检测。实时荧光pcr检测的准确性高，被视为新冠检测的“金标准”，其缺点是需要专业人员使用昂贵的仪器进行检测，同时检测需要拭子采集、保存运输、样本处理、上机检测等多个环节，耗时较长，且各环节的严格操作以及衔接，是保障核酸检测结果的必要性因素。

5、传统的核酸检测法例如cn115058542a、cn115261511a、cn114807432a、cn114410848b、cn114369688b、cn114107574a、cn113881812b等。然而，传统的核酸检测法灵敏度有待提升。

6、有鉴于此，特提出本技术。

技术实现思路

1、本技术实施例的主要目的包括提供一组检测sars-cov-2的lamp引物组，其能够和合适的分子信标搭配，实现sars-cov-2的高灵敏度检测。

2、在本技术的第一方面，提供一种检测sars-cov-2的lamp引物组，所述lamp引物组包括靶向n基因的引物组和/或靶向orf1ab基因的引物组；

3、所述靶向n基因的引物组包括如seq id no.1所示的上游外部引物f3、如seq idno.2所示的下游外部引物b3、如seq id no.3所示的上游内部引物fip、如seq id no.4所示的下游内部引物bip；

4、所述靶向orf1ab基因的引物组包括如seq id no.8所示的上游外部引物f3、如seqidno.9所示的下游外部引物b3、如seq id no.10所示的上游内部引物fip、如seq id no.11所示的下游内部引物bip。

5、在其中一些实施例中，所述lamp引物组满足如下条件中的一个或者多个：

6、(1)所述靶向n基因的引物组还包括如seq id no.5和seq id no.6所示的环引物；和，

7、(2)所述靶向orf1ab基因的引物组还包括如seq id no.12和seq id no.13所示的环引物。

8、在其中一些实施例中，所述lamp引物组还包括的靶向内参基因的引物组。

9、在其中一些实施例中，所述内参基因包括人源actin基因。

10、在其中一些实施例中，靶向所述人源actin基因的引物组包括如seq id no.15所示的上游外部引物f3、如seq id no.16所示的下游外部引物b3、如seq id no.17所示的上游内部引物fip、如seq id no.18所示的下游内部引物bip。

11、在其中一些实施例中，靶向所述人源actin基因的引物组还包括如seq id no.19和seq idno.20所示的环引物。

12、在本技术的第二方面，提供一种检测sars-cov-2的lamp核酸组合产品，所述lamp核酸组合产品包括靶向n基因的引物组和/或靶向orf1ab基因的引物组，以及n基因特异性分子信标或/和orf1ab基因特异性分子信标；

13、或者，还包括靶向内参基因的引物组，以及内参基因特异性分子信标；

14、其中，所述的靶向n基因、靶向orf1ab基因的引物组或/和所述靶向内参基因的引物组如第一方面中任一项定义。

15、在其中一些实施例中，所述lamp核酸组合产品满足如下条件中的一个或者多个：

16、(i)所述n基因特异性分子信标如seq id no.7所示，一端标记荧光基团a1，另一端标记淬灭基团b1；

17、(ii)所述orf1ab基因特异性分子信标如seq id no.14所示，一端标记荧光基团a2，另一端标记淬灭基团b2；和，

18、(iii)所述内参基因特异性分子信标如seq id no.21所示，一端标记荧光基团a3，另一端标记淬灭基团b3。

19、在其中一些实施例中，所述lamp核酸组合产品满足如下条件中的一个或者多个：

20、①所述荧光基团a1、所述荧光基团a2和所述荧光基团a3各自独立子选自6-fam、cy5、joe、hex、rox、quasar 670、tamra、texas red和vic中的一种；和，

21、②所述淬灭基团b1、所述淬灭基团b2和所述淬灭基团b3各自独立子选自bhq1、bhq2和dabcyl中的一种。

22、在本技术的第三方面，提供一种检测sars-cov-2的lamp试剂盒，所述lamp试剂盒包括第二方面中所述的lamp核酸组合产品。

23、在其中一些实施例中，所述lamp试剂盒还包括其他扩增反应试剂、样本释放剂、拭子和移液器中的一种或者多种。

24、在其中一些实施例中，所述lamp试剂盒满足如下条件中的一个或者多个：

25、(i)所述其他扩增反应试剂包含链置换bst酶、逆转录酶、ung酶、dntp、mg2so4、(nh4)2so4、kcl、bsa、dmso和tris-hcl中的一种或多种；和，

26、(ii)样本释放剂包含tween 20、tween 80、edta、甜菜碱、naoh、异硫氰酸胍和tris中的一种或多种。

27、在本技术的第四方面，提供第一方面中所述的lamp引物组或者第二方面所述的lamp核酸组合产品在非诊断目的的sars-cov-2的检测中的应用。

28、相对于传统技术，本技术的有益效果包括：

29、本技术针对所选任一靶基因中的6个区域设计的特异性引物，该特异性引物配合合适的环引物以及与扩增产物相匹配的特异性分子信标，在极限为5copies/t(tube)的靶标浓度下就能够检出，具有很好的高灵敏性。本技术基于rt-lamp技术，进一步缩短实时荧光定量pcr的所需时间，能够在25分钟内出具检测结果，检测高效。

30、另外，本技术还具有如下有益效果：(1)任何一个引物以及特异性分子信标与靶标序列不匹配均不会出现扩增曲线，检测地方性人类冠状病毒(hku1，oc43，nl63和229e)、mers-cov、sars-cov、influenza a virus、influenza b virus、rsv均无检出，具有高特异性。(2)本技术选用两组靶标引物组检测sars-cov-2基因组的保守区段的情况下，包容性强，对alpha、beta、delta、gamma、omicron ba.1/ba.2/ba.3/ba.4/ba.5病毒变异株具有同等检测性能。(3)本技术用于sars-cov-2的检测的过程中，抗干扰能力强，且对鼻拭子、咽拭子和唾液样本具有同等的检测性能。