一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法及试剂与流程

本发明涉及包含酶、核酸或微生物的测定或检验方法，具体涉及一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法及试剂。

背景技术：

1、血流感染是指由细菌、真菌等病原微生物入侵血流所致的全身性炎性反应综合征。病原微生物在循环血液中呈一过性、间歇性或持续性存在，对机体所有器官，如心脏瓣膜、关节等造成损害，严重者可导致休克、多器官衰竭，弥散性血管内凝血，甚至死亡。目前将败血症和菌血症统称为血流感染。败血症是由各种病原微生物(细菌或真菌)和毒素侵人血流所引起的血液感染。若细菌仅短暂人血而无临床明显的毒血症状则称为菌血症，可分为原发性和继发性两种。原发性菌血症与静脉内操作有关，继发性菌血症大多数由术后伤口、腹腔、尿道及肺部感染引起。近年来由于静脉导管留置、机械通气、肠外给药等侵入性设备及治疗的广泛应用，以及免疫抑制剂和大量抗菌药物的滥用，血流感染的发病率逐年上升，且由于血流感染不仅病死率高而且延长住院时间、增加住院费用等，因而受到了越来越多医患及研究者的重视。

2、引起血流感染最常见原因是细菌，例如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和肺炎球菌。除细菌感染外，真菌感染在最近已成为该疾病的重要原因。血流感染诊断和治疗方法的发展已有三十年历史，却仅有很少的进展。从血液样本中培养微生物，使微生物含量从1～10cfu/ml增加到106～108cfu/ml仍然是检测血流感染的金标准。但是这种方法有很多缺点，首先是诊断时间较长，从病人取样到提供样品的感染结果之间通常需要1～5天的诊断时间。在这段时间内，通常疗法是给病人使用广谱的非靶向性的抗生素进行治疗。这可能会在治疗该疾病方面取得效果，但会有很严重的后果，就是很多微生物会产生多重抗药性。其次，培养方法需要大量的诊断所需的血液样品且检测灵敏度很低。此外，在采血和血样使用过程中有相对较高的污染风险。所以虽然目前血培养仍然为血流感染诊断的主要参考方法，但因其灵敏度低且耗时长等显著缺点的存在，因此并不是一个理想的金标准。

3、随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应(pcr)及二代测序技术为代表的分子生物学诊断技术开始被应用于血流感染的微生物检测。基于分子生物学诊断的方法具有速度快，高灵敏度，小样本量，短时间(一般不超过12小时)内提供微生物诊断相关信息及随后可引入适当的抗生素治疗(检测耐药基因)等显著优势。但是长期以来，由于血液中极低的循环微生物数量(1～10cfu/ml)，血液本身大量人类核酸可能会干扰pcr及测序的检测，同时，血液本身的成分,如铁、血红蛋白等以及血液抗凝剂会对pcr及文库构建产生严重的抑制，因此，直接从全血对微生物进行微生物诊断一直受到限制。

4、因此快速的从全血中分离、富集到病原微生物并提取到可以用于分子生物学检测的核酸将有效的提高血流感染病原微生物的检测效率，及时为医生合理、针对性用药及治疗提供指导，同时给病人争取到黄金治疗时间，从而增加病人的生存率。

技术实现思路

1、本发明是为了提出一种从疑似血流感染病人的血液(小儿患者包括新生儿的血液用量1～2ml,成人5～10ml)中直接分离、富集感染病原微生物并提取核酸的方法及试剂，无需血液培养，直接使用血液样本进行病原体富集和核酸提取，同时也适用于血培后样本，核酸提取步骤简单，且可以无差别适用于革兰阴性菌、阳性菌及真菌，提取的核酸可搭配单重、多重pcr/rt～pcr及二代测序等多种分子生物学检测方法，操作适配仪器设备要求不高，仅需实验室常见的高速离心机即可满足操作需求。

2、本发明提供一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法，包括如下步骤：

3、s1、血液样本初次裂解：将血液样本中加入血液选择裂解液a和病原微生物助沉剂充分混匀后得到裂解物并使裂解物中的大分子有机物溶解，高速离心后弃除部分上清液，得到血液初次裂解样本；裂解物包括裂解的血细胞和未裂解但表面特性改变的病原微生物，血细胞包括红细胞和白细胞，高速离心沉降用于使病原微生物富集沉淀；

4、s2、血液样本再裂解：加入血液选择裂解液b使残留的大分子有机物进一步溶解，高速离心后弃除微生物助沉剂与水性溶液界面上的部分上清液，得到血液再次裂解样本；

5、s3、洗涤：加入洗涤液混匀后离心弃除部分上清液得到包含病原微生物的血液裂解样本，洗涤液用于清洗杂质；

6、s4、核酸提取：在血液裂解样本中加入核酸提取试剂，高速离心后弃除部分上清，将剩余溶液进行电裂解或加入不同粒径组合的研磨珠振荡后高温加热、离心，使病原微生物裂解并促使病原微生物中的核酸释放、溶解，得到病原微生物核酸样本。

7、本发明所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法，作为优选方式，步骤s1中，血液选择裂解液a包括：浓度为10～100mm的缓冲液、质量体积百分比为0％～6.5％的辅助裂解盐、质量体积百分比为5％～65％的主要裂解盐、质量体积百分比为0％～5％的表面活性剂、浓度为0～10mm的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂，血液选择裂解液a的ph为4～8；

8、病原微生物助沉剂为不溶于水的生物惰性有机溶剂；

9、血液样本为1～10ml，加入血液选择裂解液a和病原微生物助沉剂后常温振荡混匀或常温颠倒混匀1～5分钟，血液选择裂解液a的用量为血液样本体积的0.5～5倍，病原微生物助沉剂的用量为血液样本体积的0.5％～5％。

10、本发明所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法，作为优选方式，步骤s2中，血液选择裂解液b包括：浓度为10～100mm的缓冲液、质量体积百分比为0％～3％的辅助裂解盐、质量体积百分比为0％～40％的主要裂解盐、质量体积百分比为0％～2％的表面活性剂、浓度为0～10mm的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂，血液选择裂解液b的ph为5～8；

11、血液选择裂解液b的用量为血液初次裂解样本体积的2～10倍；

12、步骤s3中，洗涤液包括：浓度为10～100mm的缓冲液、质量体积百分比为0％～5％的促进杂质溶解盐和浓度为0～10mm的螯合剂，洗涤液的ph为5～9；

13、洗涤液的用量为血液再次裂解样本体积的5～10倍，洗涤液的使用方法为常温震荡混匀或常温颠倒混匀；

14、步骤s2、s3可重复多次。

15、本发明所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法，作为优选方式，步骤s4中，核酸提取液包括：浓度为0.5～20mm的缓冲液、质量体积百分比为0～5％的促进核酸溶解盐、质量体积百分比为0.01％～5％的表面活性剂、浓度为0～3mm的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂，核酸提取液的ph为7～9；

16、表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂；

17、核酸提取液的用量为血液裂解样本体积的5～10倍，电裂解使用mems加工的电裂解装置，研磨珠为粒径0.1～3mm的酸洗玻璃珠、氧化锆珠、石英砂中的一种或几种，研磨珠的用量为20～150mg、振荡时间为5～15分钟，高温加热的温度为85～100℃、加热时间为3～15分钟。

18、本发明所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法，作为优选方式，缓冲液为以下任意一种：磷酸缓冲液、乙酸钠乙酸缓冲液和三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液；

19、辅助裂解盐、促进核酸溶解盐和促进杂质溶解盐为以下一种或多种：氯化钠、氯化钾和硫酸铵；

20、主要裂解盐为以下一种或多种：氯化锂、碘化钠、碘化钾、盐酸胍和异硫氰酸胍；

21、消泡剂为以下任意一种：聚二甲基硅氧烷、聚丙二醇、聚醚改性聚硅氧烷和聚氧丙烯甘油醚；

22、螯合剂为柠檬酸三钠；

23、阴离子表面活性剂为以下任意一种：十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠，非离子表面活性剂为以下一种或多种：吐温20、吐温80、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇和十六醇聚氧乙烯醚brij c20；

24、步骤s1、s2、s3和s4中，离心转速为10000～16000×g，离心时间为1～5分钟。

25、本发明提供一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂，包括体积为血液样本0.5～10倍的血液选择裂解液a、体积为血液样本0.5％～10％的病原微生物助沉剂、体积为血液样本1～10倍的血液选择裂解液b、体积为血液样本1～10倍的洗涤液和体积为血液样本0.5～2倍的核酸提取液；

26、血液选择裂解液a和血液选择裂解液b用于仅裂解血细胞保留病原微生物并将血液样本中以及裂解血细胞中释放的大分子有机物进行溶解；病原微生物助沉剂用于使病原微生物富集沉淀；洗涤液用于清洗杂质，核酸提取液用于使病原微生物富集、裂解并促使病原微生物中的核酸释放和溶解；

27、血液选择裂解液a包括：浓度为10～100mm的缓冲液、质量体积百分比为0％～6.5％的辅助裂解盐、质量体积百分比为5％～65％的主要裂解盐、质量体积百分比为0％～5％的表面活性剂、浓度为0～10mm的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂，血液选择裂解液a的ph为4～8；

28、病原微生物助沉剂为不溶于水的生物惰性有机溶剂；

29、血液选择裂解液b包括：浓度为10～100mm的缓冲液、质量体积百分比为0％～3％的辅助裂解盐、质量体积百分比为0％～40％的主要裂解盐、质量体积百分比为0％～2％的表面活性剂、浓度为0～10mm的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂，血液选择裂解液b的ph为5～8。

30、本发明所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂，作为优选方式，洗涤液包括：浓度为10～100mm的缓冲液、质量体积百分比为0％～5％的促进杂质溶解盐和浓度为0～10mm的螯合剂，洗涤液的ph为5～9；

31、核酸提取液包括：浓度为0.5～20mm的缓冲液、质量体积百分比为0～5％的促进核酸溶解盐、质量体积百分比为0.01％～5％的表面活性剂、浓度为0～3mm的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂，核酸提取液的ph为7～9；

32、生物惰性有机溶剂为氟油或hfe-7500或novec7500或fc-40。

33、本发明所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂，作为优选方式，缓冲液为以下任意一种：磷酸缓冲液、乙酸钠乙酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液；

34、辅助裂解盐、促进核酸溶解盐和促进杂质溶解盐为以下一种或多种：氯化钠、氯化钾和硫酸铵；

35、主要裂解盐为以下一种或多种：氯化锂、碘化钠、碘化钾、盐酸胍和异硫氰酸胍；

36、消泡剂为以下任意一种：聚二甲基硅氧烷、聚丙二醇、聚醚改性聚硅氧烷和聚氧丙烯甘油醚；

37、螯合剂为柠檬酸三钠；

38、表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。

39、本发明所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂，作为优选方式，阴离子表面活性剂为以下任意一种：十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠，非离子表面活性剂为以下一种或多种：吐温20、吐温80、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇和十六醇聚氧乙烯醚brij c20。

40、本发明所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂，作为优选方式，血液选择裂解液a包括20mm三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、质量体积百分比0.5％的氯化钾、质量体积百分比65％的异硫氰酸胍、质量体积百分比0.2％的十二烷基肌氨酸钠、10mm柠檬酸三钠和体积百分比0.02％的聚氧丙烯甘油醚，血液选择裂解液a的ph为7.0；

41、血液选择裂解液b包括20mm三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，质量体积百分比0.5％的氯化钾、质量体积百分比30％的异硫氰酸胍、质量体积百分比的0.1％十二烷基肌氨酸钠、10mm柠檬酸三钠和体积百分比0.02％的聚氧丙烯甘油醚，血液选择裂解液b的ph为7.0；

42、微生物助沉剂为novec7500；

43、洗涤液包括10mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、质量体积百分比的0.9％氯化钠、质量体积百分比的10％硫酸铵和3mm柠檬酸三钠，洗涤液的ph为7.0；

44、核酸提取液包括10mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、质量体积百分比0.45％的氯化钠、质量体积百分比0.1％的十二烷基硫酸钠、质量体积百分比2％的吐温20、1mm柠檬酸三钠和体积百分比0.02％的聚氧丙烯甘油醚，核酸提取液的ph为8.8。

45、具体方案为：将血液样本中加入血液选择裂解液a和病原微生物助沉剂进行样本裂解处理，选择性裂解血细胞(包括红细胞和白细胞等)，溶解血液中的蛋白质、糖类和脂类等杂质，之后通过高速离心沉降病原微生物，小心弃除部分上清；加入血液选择裂解液b再进行一次或二次血液选择裂解、高速离心弃除微生物助沉剂与水性溶液界面上的部分上清液，之后在剩余溶液中加入洗涤液混匀后离心并继续弃除部分上清液，重复洗涤一次或多次；之后加入核酸提取试剂再次处理残留溶液，高速离心后弃除部分上清，病原微生物在剩余核酸提取液；电裂解或加入不同粒径组合的研磨珠振荡后高温加热、离心提取病原微生物的核酸。

46、在本发明的一个优选技术方案中，血液选择裂解液a的用量为血液样本体积的0.5～5倍，微生物助沉剂用量为血液样本的体积的0.5％～5％，裂解的条件为常温振荡混匀或常温颠倒混匀1～5分钟，离心转速10000～16000×g，离心时间为1～5分钟，弃上清使用移液器或注射器等，不可触及位于微生物助沉剂与水溶液两相交界处的沉淀物，溶液弃除量为总溶液体积的80％～95％。

47、在本发明的一个优选技术方案中，血液选择裂解液b的用量为剩余上清体积的2～10倍，裂解的条件为常温振荡混匀或常温颠倒混匀1～5分钟，离心转速10000～16000×g，离心时间为1～5分钟，弃上清使用移液器或注射器等，不可触及位于微生物助沉剂与水溶液两相交界处的沉淀物，溶液弃除量等同于血液选择裂解液b的加入量，本裂解步骤根据沉淀性状，重复一次或多次。

48、在本发明的一个优选技术方案中，洗涤液的用量为剩余上清体积的5～10倍，洗涤的条件为常温振荡混匀或常温颠倒混匀1～5分钟，离心转速10000～16000×g，离心时间为1～5分钟，弃上清使用移液器或注射器等，不可触及位于微生物助沉剂与水溶液两相交界处的沉淀物，溶液弃除量等同于洗涤液的加入量，本裂解步骤根据沉淀性状，重复一次或多次。

49、在本发明的一个优选技术方案中，核酸提取液的用量为剩余上清体积的5～10倍，处理的条件为常温振荡混匀或常温颠倒混匀1～5分钟，离心转速10000～16000×g，离心时间为1～5分钟，弃上清使用移液器或注射器等，不可触及位于微生物助沉剂与水溶液两相交界处的沉淀物，溶液弃除量等同于核酸提取液的加入量，剩余上清和沉淀中包含从样本中富集的病原微生物。

50、在本发明的一个优选技术方案中，研磨珠为0.1～3mm不同粒径组合的酸洗玻璃珠或氧化锆珠，用量为20～150mg，振荡时间为5～15分钟，高温加热的温度为85～100℃，加热时间为3～15分钟，离心转速10000～16000×g，离心时间为1～5分钟，离心后用移液器或注射器吸取上清液即为目的核酸。

51、在本发明的一个优选技术方案中，核酸提取使用微加工的电裂解装置，尺寸可为(0.1～1)×(5～1000)×(10～1000)mm3,根据需求尺寸可大于或小于本设计尺寸。裂解电压为10～2000v。

52、在本发明的一个优选技术方案中，血液样本为疑似血流感染病人的血液，小儿患者包括新生儿的血液用量1～2ml，成人5～10ml；样本也可为血液培养后样本，用量0.2～1ml。

53、本发明通过血液选择裂解液a与血液的渗透压差和表面活性剂的添加破裂血细胞(包括红细胞和白细胞等)，同时在适宜的浓度下尽可能的溶解血液中及血细胞破裂所释放出的大分子有机物等，且不会对病原微生物细胞结构造成严重损伤。并且其中的盐类、表面活性剂还可以与微生物助沉剂一起促进那些因具有特殊细胞外结构(如细菌荚膜)而难以离心沉淀的病原微生物富集沉淀，减少微生物的差异化富集。微生物助沉剂还可以减少微生物与离心管之前的黏附，避免微生物离心沉降不完全而产生丢失。血液选择裂解液b的添加弥补因样本差异造成的裂解处理不完全并充分溶解残留杂质。洗涤液去除裂解液中存在的可能对下游检测造成抑制的裂解液成分和血液难溶物质。大量的核酸提取液稀释洗涤液中的盐类并提供适合病原微生物裂解和核酸溶解、保存的条件，在瞬时电裂解或者不同粒径研磨珠的物理研磨和高温加热变性作用下，充分裂解病原微生物促进其中核酸的释放和溶解。

54、大分子有机物包括蛋白质、糖类、脂类和核酸等。

55、本发明具有以下优点：

56、(1)可从不大于10ml的血液样品中，快速、准确的提取到能满足分子生物学检测要求的目标感染病原体核酸。

57、(2)无需血液培养，直接使用血液样本进行病原体富集和核酸提取，同时也适用于血培后样本。

58、(3)核酸提取步骤简单，且可以无差别适用于革兰阴性菌、阳性菌及真菌。

59、(4)提取的核酸可搭配单重、多重pcr/rt～pcr及二代测序等多种分子生物学检测方法。

60、(5)操作适配仪器设备要求不高，仅需实验室常见的高速离心机即可满足操作需求。