一种智能微生态处理分析检测设备及检测方法与流程

本发明涉及微生物检测，具体为一种智能微生态处理分析检测设备及检测方法。

背景技术：

1、微生物菌群个体小，数量庞大，群系复杂，目前对微生物菌群的研究还是停留在传统的平板培养分析上(培养代时长，无法对凋亡菌群，死亡菌群进行有效计数)，对菌群的分析还是停留在高通量dna鉴定上，分析时间长，无法满足对微生物生长实时性分析的需求，滞后性比较强。

2、传统检测微生物数量及种类方式，如图1所示，需要用到特定的鉴别培养基平板进行传统的涂布平板按照逐级稀释进行计数，待长成完全的肉眼可见的单菌落，再进行判别菌群种类及计数，通常在这种情况下，一般需要1d才能出结果，根据微生物菌群的不同，有的需要2d，3d，甚至7d才能出结果，而且只能统计活的菌群数量，无法对凋亡菌群及死亡菌数统计；而微生物菌群类别的分析只能通过pcr设备扩增提取核酸后才能做出dna鉴定。滞后性非常强。为了解决以上难题，设计出了一套在线全新智能微生态检测系统(ime)，可以实时检测微生物数量及菌群种类。

技术实现思路

1、本发明提供了一种智能微生态处理分析检测设备及检测方法，解决了上述背景技术中提出的现有的传统的人工平板涂布来分析微生物样品，分析层面少，检测时间长，分析滞后性等问题。

2、本发明提供如下技术方案：一种智能微生态处理分析检测设备，对样品进行自动稀释和自动染色反应，把染色反应后的样品输送至检测系统内进行激光照射，染色剂中的sybrgreen成分进入所有菌体细胞，染色剂中的碘化丙啶成分只能进入受损菌体。这两种染料都与dna结合，当sybrgreen和碘化丙啶结合时，只有sybrgreen进入完整的菌体，在488nm的激光激发下，这些菌体发出绿色荧光。在受损菌体中，sybrgreen和碘化丙啶都会进入菌体并与dna结合。sybrgreen将被488nm激光器激发；它的发射荧光激发pi发射荧光，产生荧光能量转移，导致绿色的荧光淬灭，而红色的荧光增高。随着菌体细胞膜损伤程度的增加，进入菌体的碘化丙啶增多，发射光就会呈现红色。根据不同的荧光强度分成两种类群，即细胞膜完好的活菌和细胞膜受损的菌或死菌，检测结果通过显示屏进行展示。

3、一种智能微生态处理分析检测设备，包括生物样品采样模块、生物样品稀释模块、生物样品反应模块、微生物检测模块和显示屏，所述生物样品稀释模块包括样品采集泵、主罐、副罐和试剂管路一和试剂管路二，所述样品采集泵的出液口与试剂管路一顶部的进液口连接，所述试剂管路一通过试剂管路二与副罐连接，所述副罐通过试剂管路二与主罐连接；

4、所述生物样品反应模块包括柱塞泵、反应罐和切换阀，所述柱塞泵的进液口通过切换阀与主罐的内腔连接，所述柱塞泵的出液口通过管道与反应罐的内腔连接；

5、所述生物样品采样模块的顶部设有微生物检测模块，所述生物样品采样模块的内腔内设有定量泵，所述定量泵的进出液口固定连接有储液管路，所述储液管路的另一端固定连接有转接头，所述转接头的一端与反应罐连接；

6、所述微生物检测模块的内腔内固定连接有适配器、电源板、激光器一、激光器二、fl1通道、fl2通道、fl3通道、fl4通道和蠕动泵，所述激光器一和激光器二之间为流动室，所述转接头的另一端与流动室连接；

7、所述微生物检测模块的顶部放置有鞘流液瓶、废水瓶、染色剂瓶和乙醇瓶，所述蠕动泵的进液口与鞘流液瓶连接，所述蠕动泵的出液口与流动室连接，所述柱塞泵的进液口通过切换阀与染色剂瓶和乙醇瓶连接。

8、优选的，所述反应罐的外围固定连接有加热丝，所述反应罐的内部固定连接有感温探头，所述反应罐的内腔内固定连接有气泵。

9、优选的，所述激光器一和激光器二均激发出特定光谱，所述激光器一激发488nm激光，所述激光器二激发638nm激光，所述激光器一和激光器二与流动室之间均设有光束整形透镜。

10、优选的，所述乙醇瓶内放置有75％乙醇。

11、优选的，所述转接头与反应罐连接的一端设有电动球阀。

12、一种智能微生态处理分析检测设备的检测方法，包括以下步骤：

13、步骤一、对生物样品稀释模块设备进行灭菌和清洗，样品采集泵抽取定量样品到副罐内，样品采集泵再抽取定量的稀释液到副罐内，完成第一次稀释，再抽取副罐中的定量样品到主罐中，再抽取定量的稀释液到主罐中，完成第二次稀释，以此类推，完成样品的稀释步骤；

14、步骤二、对生物样品反应模块设备进行灭菌和清洗，生物样品反应模块通过柱塞泵抽取定量的稀释样品到反应罐中，然后通过切换阀加入染色剂工作液进行染色；

15、步骤三、样品和反应试剂经过气泵鼓入气泡混匀后，在36.5-37.5℃的温度下保温12-14分钟；

16、步骤四、用具有体积定量的定量泵从反应罐内吸取定量的微生物样品，经过电动球阀和转接头把微生物样品储存在储液管路中，关闭电动球阀，定量泵把储液管路内的微生物样品通过转接头的另一端注入流动室内；

17、步骤五、蠕动泵把鞘流液注入到流动室内；

18、步骤六、激光器一和激光器二同时照射微生物样品，sybrgreen染色剂进入完整菌体中，在488nm的激光激发下，这些菌体发出绿色荧光，在受损菌体中，sybrgreen染色剂和碘化丙啶死/活染色剂都会进入菌体并与dna结合，sybrgreen将被488nm激光器激发，它的发射荧光激发碘化丙啶死/活发射荧光，产生荧光能量转移，导致绿色的荧光淬灭，而红色的荧光增高，根据荧光颜色，得到微生物样品中含有的菌数、细胞膜完好的菌数和细胞膜完好的菌数及细胞膜受损的菌或死菌数；

19、步骤七、微生物检测模块将获取的信息反馈到pc端，生物样品的分析报告通过显示屏进行显示。

20、优选的，所述稀释液的成分为8.5g的氯化钠和1000ml的蒸馏水，所述稀释液的制备方法为把8.5g的氯化钠溶解在1000ml的蒸馏水中，并在121℃温度下灭菌30min。

21、优选的，所述步骤六中所用的激光器一和激光器二均为半导体tec温控激光器。

22、优选的，所述染色剂工作液的成分为二甲亚砜溶液，greeni，10000xindmsoinvitrogen，碘化丙啶(20mmindmso)；

23、所述染色剂工作液的制备方法为：0.22微米过滤器过滤dmso溶液，取970μldmso溶液，然后添加10μlsybrgreeni10000倍浓缩液(greeni，10000xindmsoinvitrogen)，并添加20μl碘化丙啶(20mmindmso)，涡流震荡，覆盖铝箔避光，存贮于-20℃冰箱6个月内使用。

24、与现有技术对比，本发明具备以下有益效果：

25、1、该智能微生态处理分析检测设备及检测方法，通过缩短微生物样品的检测时间，实时在线检测，可以实时了解微生物的生长状态，死活菌群，凋亡菌群的对比，解决了用传统平板检测带来的一系列弊端。也及时体现了微生物生长的即时性。

26、2、该智能微生态处理分析检测设备及检测方法，精确控制样品数量，提高检测精度和节省实验材料，利用机器代替人工，对样品进行自动稀释和自动染色反应，提高科研效率，使用该方法可以大大缩短检测周期，节约人工成本，在30min之内即可以出具检测结果，其检测结果和传统平板检测结果都统一在一个数量级上，该方法的检测结果包含：微生态菌群种类，微生物活菌数量，死菌数量，凋亡菌数量。