一种灵芝及其孢子粉的分子鉴定方法与流程

本发明涉及灵芝及其孢子粉的鉴别，具体涉及一种dna信息因加工后降解严重的市售的灵芝及其孢子粉的分子鉴定方法。

背景技术：

1、灵芝是灵芝属赤芝或紫芝的子实体，含有丰富的活性成分，如多糖、生物碱、三萜类化合物等，是一种名贵的药食两用真菌。现代药理研究表明灵芝具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等多种功效。随着人们生活水平和保健意识的逐渐提高，灵芝因其丰富的药理活性被作为药材及食品广泛应用在人们日常生活中，其市场价值和产品需求量接连上升，产业规模迅速壮大。但是国际和国内市场上的灵芝及其孢子产品存在用灵芝混伪品以假乱真、以次充好等不同程度的掺假情况。

2、传统灵芝鉴定方法主要依据待测样品的形态，因此对灵芝形态的完整性要求较高，同时对鉴定人员的物种鉴定能力要求也较高，更重要的是，传统鉴定方法不适用于加工后的灵芝产品及其孢子产品的鉴定。dna条形码技术是一种新型物种分子鉴定技术，近年来被广泛应用于中草药领域的物种鉴定。已有研究将dna条形码技术用于灵芝及其混伪品的鉴别，但通常要求待测样品具有完整的dna信息，适用于新鲜的灵芝菌丝或未经加工的灵芝子实体。如中国专利申请202110273122.8公开了一种鉴别灵芝属真菌的候选dna条形码，包括核糖体小亚基(ssu)，核糖体转录间隔区(its)，核糖体大亚基(lsu)，条带大小约为3000bp，扩增引物含有6条序列，利用灵芝属真菌核糖体的dna遗传信息鉴定灵芝属真菌。而市售的灵芝及其孢子粉为经过物理破壁、高温灭菌等炮制过程的加工品，dna降解严重，dna信息不完整，pcr扩增效率极低，采用目前的dna条形码技术鉴别难度较大。因此，迫切需要建立一套适用于市售灵芝及其孢子粉加工品的鉴别方法，用以规范市场灵芝及其孢子粉的标签符合情况。

技术实现思路

1、针对市售灵芝及孢子粉因为破壁、高温灭菌等操作dna降解严重，不宜采用现有dna条形码技术鉴定的问题，本发明的目的在于提供一种灵芝及其孢子粉的分子鉴定方法，通过优化dna提取方法和pcr扩增条件，实现dna信息的快速、高效提取，pcr扩增效果高，然后基于its序列和its2序列进行鉴定，能够实现破壁等加工后dna降解严重的市售灵芝及其孢子产品的高效、准确鉴定。

2、本发明提供如下的技术方案：

3、一种灵芝及其孢子粉的分子鉴定方法，包括如下步骤：

4、步骤s1：改进的一步法或水浴法快速提取待测样品的模板dna；

5、步骤s2：对提取的模板dna进行its序列或its2序列pcr扩增；

6、步骤s3：pcr产物质量检测与测序；

7、步骤s4：获取its或its2序列，基于its或its2序列的亲缘关系分析。

8、本发明的分子鉴定方法，通过改进的一步法或水浴法快速提取待测样品的模板dna，并结合特定的pcr扩增条件，能够实现dna降解严重的灵芝及其孢子粉产品的dna信息高效、准确扩增，然后基于its和its2序列进行鉴定，对于灵芝及其孢子类产品具有极高的鉴定效率，突破传统形态鉴定技术的限制，可用于鉴定dna降解严重的市售灵芝及其孢子粉产品，当然也适用于形态完整的灵芝以及新鲜的灵芝菌丝等未经加工的灵芝原料鉴定。

9、作为本发明方法的优选，改进的一步法提取待测样品的模板dna为：向待测样品中加入dna提取液，室温静置3～4min，分离取上清液，所用dna提取液为用buffer solution稀释5倍的lysis solution。可以实现高效、快速提取dna降解严重的灵芝产品或孢子粉产品的dna信息，满足pcr扩增需求。

10、作为本发明方法的优选，

11、buffer solution按照以下组分制备：10mm tris-hcl，1mm edta；

12、lysis solution按以下组分制备：10mm tris-hcl，250mm nacl，1mm edta和0.5％sds。

13、作为本发明方法的优选，改进的水浴法提取待测样品的模板dna：取待测样品研磨后加入ddh2o，待测样品与ddh2o的质量体积比为1mg:10～15μl，涡旋至完全混匀，随后95℃孵育10min，分离取上清液。

14、作为本发明方法的优选，

15、its序列pcr扩增的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq idno.2所示；its2序列pcr扩增的上游引物序列如seq id no.3所示，下游引物序列如seq idno.4所示。

16、作为本发明方法的优选，pcr扩增反应体系为：20μl含2×rapid taq master mix10μl，正反向引物各1μl，浓度10μmol/l，待测样品dna模板1μl，ddh2o补至20μl；

17、pcr扩增反应条件为：

18、95℃预变性3min，95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸15s、35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。pcr扩增成功率高，扩增效果较为理想。

19、作为本发明方法的优选，pcr产物质量检测与测序为pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将具有单一明亮目的条带的产物进行双向测序。

20、作为本发明方法的优选，获取its或its2序列的方法为：

21、利用序列编辑软件对测序结果进行校对拼接，去除引物区和两端低质量序列即可获得its序列；对于its2序列还需要通过基于隐马尔可夫模型hmmer注释除去5.8s和28s区段，获得its2序列。

22、作为本发明方法的优选，基于its或its2序列的亲缘关系分析为：

23、对所得its序列或者its2序列进行blast比对，找出最相似序列进行物种鉴别；

24、或者，利用mega11对所得对所得its序列或者its2序列进行多重比对，根据kimura-2计算种间、种内遗传距离，并基于neighbor-joining构建系统发育树，至少运行1000次bootstrap检验评价系统发育树拓扑结构的可靠性。

25、作为本发明方法的优选，

26、待测样品选自its核苷酸序列如seq id no.5至seq id no.44中的一种或多种；

27、和/或，待测样品选自its2核苷酸序列如seq id no.45至seq id no.84中的一种或多种。

28、本发明的有益效果如下：

29、1)本发明通过改进的一步法或者直接水浴法，能快速、高效地提取经加工后dna降解严重的灵芝及其孢子粉加工品的dna，pcr扩增成功率增强，而且分子鉴定时间大大缩短；

30、2)本发明利用its和its2序列变异位点丰富，进化速度快，对于灵芝及其孢子类产品具有极高的鉴定效率，突破传统形态鉴定技术的限制；

31、3)本发明方法可高效、准确的鉴定dna降解严重的市售灵芝及其孢子类产品，相比于传统鉴定技术耗费时间更短，且重复性更好，有助于了解市场掺假现象，以便于严格规范灵芝市场，确保中药材市场用药安全，对于灵芝及其孢子类产品市场监督和检测具有重要现实意义；4)本发明的方法也适用于形态完整的灵芝，新鲜的灵芝菌丝等未加工的灵芝原料鉴定。