一种制备超低分子量透明质酸钠的方法与流程

本发明涉及透明质酸制备工艺，尤其涉及一种制备超低分子量透明质酸钠的方法。

背景技术：

1、透明质酸是一种由单位d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。目前市场中分子量约在10-300万道尔顿或者更高。

2、透明质酸钠作为一种糖胺聚糖，广泛存在于人体的关节软骨、皮肤真皮、胎盘等组织中。在细胞质、细胞间质中可起到润滑滋润作用，在皮肤中还有保湿作用，还可以促进伤口愈合。有文献指出，透明质酸钠对伤口愈合，抑制炎症有明显疗效(kobayashi t,chanmeet,itano n.hyaluronan:metabolism and function.biomolecules.2020 nov 7；10(11):1525.)。因其特殊功效，透明质酸钠现已广泛被用于眼科、骨科手术，为组织关节提供润滑缓冲作用。同时在化妆品行业，食品行业，医用品行业中作为各类添加剂。

3、平均分子量大于10万的大分子透明质酸的来源主要有两种，一种是通过微生物发酵获得平均分子量在100万以上的透明质酸。另一种是通过动物组织提取，如鸡冠中提取，该提取方法产量低，获得的透明质酸平均分子量在10万-100万。而平均分子量小于10万的透明质酸主要通过水解获得。

4、相比大分子透明质酸钠，平均分子量在1万以下透明质酸钠有可能渗透进入皮肤角质层，口服易于被人体吸收，也可以作为保健食品的添加剂。有文献报道指出，2～6单位结构的低分子量透明质酸，可以口服吸收减少炎症，一项为期12月周期的临床实验显示，30名患者口服未见负面作用，证明口服透明质酸钠有较高的安全性，且临床实验数据显示对关节疼痛有有益作用(valachová k,l.hyaluronan as a prominent biomoleculewith numerous applications in medicine.int j mol sci.2021 jun 30；22(13):7077.)。另一项研究分子量低于1万的透明质酸钠，可以与cd44等细胞受体结合，促进血管生成伤口愈合。

5、专利cn102876748a公开了酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用，专利cn103255187a公开了一种低分子透明质酸盐、其制备方法及用途，专利cn 108220364a公开了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法。以上专利均采用了游离透明质酸酶酶解制备低分子量透明质酸钠，需要通过灭活或有机溶液的抽提等工序，来制备透明质酸钠的平均分子量均大于5000道尔顿。但是目前没有更好的去除酶残留解决方法。

6、而专利cn108484796a、专利cn101146830a，采用异丙醇、丙酮等对人体有毒害性的有机溶剂制造透明质酸钠，制备的透明质酸钠平均分子量大于5000道尔顿。以上各种化学方法制备超低分子量透明质酸钠，存在引用有毒害有机试剂的问题，对产品质量有影响。cn106434618a中对透明质酸酶进行包埋固定化处理，该方法虽然提到了固定化透明质酸酶用于生产透明质酸，但该固定化酶在重复使用11次后酶活只保留了30％。酶活损失多，严重影响对透明质酸的降解效率。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种利用固相化酶制备超低分子量透明质酸钠的方法，其解决了现有技术中低分子透明质酸钠存在酶及有毒害有机试剂残留、对透明质酸的降解效率低的问题。

2、本发明提供一种制备超低分子量透明质酸钠的方法，采用固定化透明质酸酶对大分子透明质酸钠进行酶解，得到平均分子量小于2000道尔顿的超低分子量透明质酸钠。

3、进一步地，包括以下步骤：s1：在大分子透明质酸钠中加入固定化透明质酸酶进行酶解，得到酶解液；

4、s2：将酶解液过滤，干燥得到超低分子量透明质酸钠。

5、进一步地，所述固定化透明质酸酶采用以下方法制备：将含n-羟基琥珀酰亚胺基团的固相化载体与透明质酸酶共价偶联反应而得到，

6、优选地，按u/g计，透明质酸酶与含n-羟基琥珀酰亚胺基团的固相化载体的用量比为5000-55000:1；反应温度为15-37℃，ph7.5-8.0，反应时间为0.5-2h。

7、进一步地，所述固相化载体包括琼脂糖凝胶、硅胶、聚丙烯酸酯中的任一种，优选聚丙烯酸酯、硅胶。

8、进一步地，步骤s1前，还包括对大分子透明质酸钠进行加热和低ph值处理的步骤。

9、加热和低ph值处理可提高提高对大分子透明质酸钠的水解效果。

10、进一步地，所述加热和低ph值处理的步骤包括：

11、(1)将大分子透明质酸钠溶于水，加热至90℃-100℃，处理1-2小时；

12、(2)冷却至50-65℃，加入终浓度为0.05-0.5mol/l盐酸，搅拌处理6-12小时；

13、(3)加入终浓度为10-100mmol/l磷酸盐缓冲，调节ph至6.0-8.0。

14、进一步地，步骤(1)中，大分子透明质酸钠的浓度为5％-20％。

15、进一步地，步骤s1中，按g/u计，大分子透明质酸钠和固定化透明质酸酶的用量比为1:1000-40000；酶解温度为25-40℃，酶解时间为24-240小时。

16、进一步地，步骤s2中，所述干燥为为喷雾干燥或真空干燥；干燥后超低分子量透明质酸钠的干重含量不低于75％。

17、本发明另一方面，提供一种制备超低分子量透明质酸钠的方法在制备护肤品、食品和医用添加剂中的应用，所述添加剂为超低分子量透明质酸钠，添加量为0.01％-5％。

18、超低分子量透明质酸钠可加入护肤品、食品、医用品中，起到保湿润肤紧致等功效。还可以按每日用量可加入到保健食品中。

19、具体来说，以聚丙烯酸酯(pmma)为基质(或称固相化载体)的固定化透明质酸酶的制备方法为：

20、首先，制备含nhs活化基团的聚丙烯酸酯固相载体：将含有cooh基团的聚丙烯酸酯(pmma)微球100g，与用6.9g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(6.9g nhs溶解于50ml乙酸乙酯)混匀后，加入9.3ml二异丙基碳二亚胺(dic)进行催化反应室温，获得含nhs活化基团的的聚丙烯酸酯固相载体。

21、其次，选择含nhs活化基团的聚丙烯酸酯固相载体100g，用异丙醇润洗3次，再用5mmol/l盐酸润洗3次；透明质酸酶溶解于20mmol/l磷酸盐缓冲液(ph 8.0)，终浓度为2-5g/l。按u/g计，透明质酸酶与固相化载体与的用量比为5000-55000:1；反应条件为15-37℃，ph7.5-8.0，反应时间为0.5-2h；反应结束，过滤，洗涤得到最终固定化透明质酸酶。

22、具体来说，以琼脂糖凝胶为基质的固相化透明质酸酶的制备方法为：

23、选择含nhs活化基团的琼脂糖凝胶颗粒载体100ml，用异丙醇润洗3次，再用5mmol/l盐酸润洗3次；透明质酸酶溶解于20mmol/l磷酸盐缓冲液(ph 8.0)，终浓度为2-5g/l。按u/g计，透明质酸酶与固相化载体与的用量比为5000-55000:1；反应条件为15-37℃，ph7.5-8.0，反应时间为0.5-2h；反应结束，通过过滤，洗涤得到最终固定化透明质酸酶。

24、具体来说，取分子量为30-100万的透明质酸钠50-100g，溶解于1l 50mmol/lph6.0-8.0pb缓冲液中，配制透明质酸钠终浓度为5-10％。补入50万-200万单位的固相化透明质酸酶，37℃，搅拌反应24小时以上，获得平均分子量低于2千的透明质酸钠。

25、具体来说，取纯化水1l加热至沸腾后，加入50-100g分子量取分子量为30-100万的透明质酸钠，至终浓度为5-10％，溶解后，自然冷却至50-60℃，补入终浓度为0.05-0.5mol/l盐酸，继续搅拌至不明显粘稠。冷却至37℃，补入终浓度为50mm pb缓冲液调节ph至6.0-8.0。加入30万-120万单位的固相化透明质酸，继续搅拌反应24小时以上，获得平均分子量低于2千的透明质酸钠。

26、本发明中，透明质酸酶包括但不限于，动物组织提取的如牛睾丸提取透明质酸酶，重组生产的如重组人透明质酸酶(ph20)。动物提取的透明质酸酶，如牛睾丸提取的透明质酸酶最适ph为5.0，含有动物源性杂质，纯度一般低于50％，活比活性较低约为400-1000单位/mg。但经本发明的固相化酶技术，可使动物提取的透明质酸酶在ph6-8之间依然保留活性，并且固化酶酶活保留50％以上。人类基因组中有6中透明质酸酶基因，分别是hyal1、hyal2、hyal3、hyal4、hyalp1、和ph20/spam1。其中ph20是中性透明质酸酶，最适酶活ph范围在6.0至9.0，其余是酸性活性透明质酸酶，最适酶活ph在5.0及以下。本发明的的ph20以cho重组表达，其分子量约60kda，经离子层析得到纯度为90％以上，比活性6万单位/mg。经本发明的固相化技术，固化ph20酶活保留70％以上。本发明整个工艺过程中优选采用重组人ph20进行固化，用于制备超低分子量透明质酸钠。

27、按分子量的大小，透明质酸分为大分子透明质酸、中分子透明质酸、小分子透明质酸、超低分子量透明质酸。具体可以分为以下四类：

28、1.高分子量透明质酸：透明质酸分子量高于2000kda。

29、2.中等分子量透明质酸：透明质酸分子量在500kda─2000kda之间

30、3.低分子量透明质酸：透明质酸分子量在10kda─500kda之间

31、4.超低分子量透明质酸(寡聚透明质酸)：透明质酸分子量小于10kda，即小于50个单糖结构，聚合度小于25的透明质酸分子。

32、本发明中术语“大分子透明质酸钠”，是指平均分子量不低于10万道尔顿的透明质酸钠。

33、本发明的技术原理为：现有技术中一般利用游离透明质酸酶制备透明质酸，发明人尝试利用酶固定法制备透明质酸。发明人在试验过程中发现，采用n-羟基琥珀酰亚胺活化固相载体进行共价偶联的方法制备的透明质酸酶的性能最佳，可最大限度地保留酶活性和提高酶的稳定性，进一步得到分子量小于2k道尔顿的透明质酸。其效果好于采用包埋法或交联法固定透明质酸酶制备超低分子量透明质酸钠的方法。这可能是由于酶的活性中心构造可能受到影响，从而影响对大分子透明质酸钠的降解。

34、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

35、(1)本发明中固相化酶的酶活保留高达86％，每克固相化载体中酶活性不低于3万单位。

36、(2)本发明中固相化酶可反复循环使用不低于15次，酶活保留率80％以上。

37、(3)本发明中固相化酶酶解效率高，72小时内即可将大分子透明质酸钠降解为分子量低于2千道尔顿的超低分子量透明质酸钠。

38、(4)本发明制备方法得到的酶解产物中超低分子量透明质酸钠含量高，按干重计，其含量不低于75％。

39、(5)本发明制备方法安全环保，未使用有机溶剂，且无酶残留，更符合作为护肤品、食品、医用品添加的安全要求。

40、(6)本发明制备方法简单易操作，条件温和，反应条件容易控制，适用于大规模工业化生产。