表达IL-12的SINV载体及其在制备抗肿瘤药物中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种表达il-12的sinv载体及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

1、脑胶质瘤被称为“大脑杀手”，占中枢神经系统所有恶性肿瘤的近80％。根据2016年who分类，胶质瘤分为四个等级：i到iv。在成人中，最常见的恶性胶质瘤亚型是iv级胶质瘤，其中胶质母细胞瘤(gbm)是颅脑常见的恶性胶质瘤，其在基因分子水平诊断上分两种，分为idh野生型和idh突变型，idh突变即为为异柠檬酸脱氢酶突变，是在这种肿瘤中发现的最重要的遗传改变之一。在总生存率方面，胶质瘤的生存率并不理想。在美国，恶性胶质瘤和胶质母细胞瘤的总体10年生存率分别为44.6％和2.9％。

2、辛德毕斯病毒(sindbis virus，sinv)是alphavirus属的成员和具有显着溶瘤活性的溶瘤病毒。辛德毕斯病毒载体具有使其成为癌症治疗的良好候选者的几个优点。辛德毕斯病毒具有正向单链rna基因组，长度约为12kb，共编码5个结构蛋白(capsid、e3、e2、6k和e1)和4个非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3和nsp4)。使载体比基于dna的溶瘤病毒更安全，因为载体不能将其基因组整合到宿主的dna中。在人类中，辛德比斯感染被认为是无症状的，尽管不常见，但它会导致轻度发烧、皮疹和关节痛，这些症状会迅速消退。

3、白细胞介素-12(il-12)是一种强大的抗肿瘤免疫反应的主要调节剂，作为异二聚体细胞因子，它产生多方面的抗肿瘤作用，包括刺激自然杀伤(nk)细胞和t细胞(cd4+和cd8+)的生长和细胞毒活性，诱导cd4+t细胞向th1表型分化，增加nk和t细胞产生的ifn-γ，以及抑制肿瘤血管生成。

4、溶瘤病毒(oncolytic virus)免疫疗法在过去几十年中已成为治疗癌症新兴的治疗方法。2015年，talimogene laherparepvec(t-vec)成为美国食品和药物管理局(fda)批准的第一个溶瘤病毒。溶瘤病毒(ovs)是能够识别、感染和溶解肿瘤环境中不同细胞的生物，旨在稳定和减少肿瘤进展。它们可以向癌细胞呈现自然趋向性，或者通过基因定向来识别特定目标。一些ovs正在被研究作为临床试验中癌症的潜在治疗方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足，本发明提出了一种稳定表达il-12的sinv感染性载体及其病毒颗粒和应用，并评估该病毒颗粒对肿瘤微环境的影响以及在恶性胶质瘤u87-mg小鼠皮下肿瘤模型中的效果。本发明利用辛德毕斯病毒感染性载体转染细胞成功制备出能够稳定表达il-12的辛德毕斯病毒颗粒，并成功应用于恶性胶质瘤u87-mg小鼠模型的溶瘤治疗。

2、本发明提供一种稳定表达il-12的sinv感染性载体，所述sinv感染性载体以psinv为骨架载体，在所述骨架载体上连接有il-12；所述sinv感染性载体上连接有ubc启动子、5’utr、nsp1基因的核苷酸序列、nsp2基因的核苷酸序列、nsp3基因的核苷酸序列、nsp4基因的核苷酸序列、26s启动子、cap基因的核苷酸序列、e3基因的核苷酸序列、e2基因的核苷酸序列、6k基因的核苷酸序列、e1基因的核苷酸序列、26s启动子、il-12基因的核苷酸序列、3’utr。

3、进一步地，所述sinv感染性载体的核苷酸序列如seq id no.7所示。

4、序列seq id no.7总长度为16707bp，其第15921-16707位的碱基如下：

5、gtggccgccgggccgctcggtgggacggaagcgtgtggagagaccgccaagggctgtagtctgggtccgcgagcaaggttgccctgaactgggggttggggggagcgcagcaaaatggcggctgttcccgagtcttgaatggaagacgcttgtgaggcgggctgtgaggtcgttgaaacaaggtggggggcatggtgggcggcaagaacccaaggtcttgaggccttcgctaatgcgggaaagctcttattcgggtgagatgggctggggcaccatctggggaccctgacgtgaagtttgtcactgactggagaactcggtttgtcgtctgttgcgggggcggcagttatggcggtgccgttgggcagtgcacccgtacctttgggagcgcgcgccctcgtcgtgtcgtgacgtcacccgttctgttggcttataatgcagggtggggccacctgccggtaggtgtgcggtaggcttttctccgtcgcaggacgcagggttcgggcctagggtaggctctcctgaatcgacaggcgccggacctctggtgaggggagggataagtgaggcgtcagtttctttggtcggttttatgtacctatcttcttaagtagctgaagctccggttttgaactatgcgctcggggttggcgagtgtgttttgtgaagttttttaggcaccttttgaaatgtaatcatttgggtcaatatgtaattttcagtgttagactagtaaattgtccgctaaattctggccgtttttggcttttttgttagacttaattaa。

6、本发明还提供一种携带il-12的辛德毕斯病毒颗粒的制备方法，使用所述的sinv感染性载体转染细胞。

7、进一步地，所述细胞为bhk细胞。

8、本发明还提供一种携带il-12的辛德毕斯病毒颗粒，由所述的sinv感染性载体转染细胞后制备得到。

9、本发明还提供所述携带il-12的辛德毕斯病毒颗粒在制备改善肿瘤微环境药物中的应用。

10、本发明还提供所述携带il-12的辛德毕斯病毒颗粒在制备治疗恶性胶质瘤药物中的应用。

11、与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

12、(1)本发明提供了一种稳定表达il-12基因的辛德毕斯病毒感染性载体，无需体外转录和rna转染细胞的步骤，直接用辛德毕斯病毒感染性载体转染细胞即可，节省时间和操作步骤。本发明的sinv感染性载体能够稳定地表达插入的外源基因，有助于开展辛德毕斯病毒感染性载体作为一种新型溶瘤病毒相关的研究。

13、(2)本发明对于研究辛德毕斯病毒作为一种新型的溶瘤病毒的应用前景具有重要价值，同时对于恶性胶质瘤的溶瘤治疗等应用性研究和基础性研究(如病毒在肿瘤细胞中的杀伤机制，对肿瘤内部免疫细胞的改变等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

14、(3)本发明制备的辛德毕斯病毒颗粒能够在5天内提高u87-mg细胞免疫缺陷小鼠模型实体瘤瘤内细胞中t细胞、cd8+t细胞和nk细胞的数量。

15、(4)本发明制备的辛德毕斯病毒颗粒能够在7天内在u87-mg细胞免疫缺陷小鼠模型实体瘤上发挥明显杀瘤作用。

16、(5)溶瘤病毒疗法利用基因工程的手段对溶瘤病毒进行改造，使其保留病毒的复制能力，靶向地递送到肿瘤细胞处，杀伤肿瘤细胞，达到治疗的目的。合适的溶瘤病毒对于肿瘤治疗具有重要意义，本发明的sinv病毒颗粒能够在恶性胶质瘤u87-mg细胞内复制、选择性地感染肿瘤细胞，并在免疫缺陷小鼠模型中实现对肿瘤的杀伤作用。