一种生产L-苹果酸的双酶共表达菌株及其构建方法与应用与流程

本发明涉及生物工程领域，涉及一种生产l-苹果酸的双酶共表达菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、l-苹果酸是一种重要的四碳二羧酸，广泛应用于食品、医药、电子、燃料、化工等领域。在食品行业，由于其酸味持久柔和、解渴爽口、风味别致、性质稳定，主要用作食品、饮料中的酸味剂，是目前世界食品行业中公认的安全、无毒无害的食用有机酸。在医药行业，l-苹果酸被用于治疗肝病、尿毒症、贫血等多种疾病。此外，l-苹果酸常被配入复合氨基酸注射液中促进氨基酸的吸收。因此，国际市场上对l-苹果酸的需求量与日俱增。美国能源部将苹果酸作为可通过微生物发酵生产的12种平台化合物之一。

2、目前，l-苹果酸的生产方法主要为生物合成法，具体包括一步发酵法、两步发酵法和酶法催化。化学合成法生成dl-苹果酸，产物难以分离精制得到l-苹果酸，该方法已经基本被淘汰。一步发酵法是指只用一种微生物以糖质或非糖质为原料发酵生产l-苹果酸，但是该菌不仅会产生对人体有毒害的黄曲霉毒素，而且伴随l-苹果酸生成的副产物，也难以有效去除，尚无法应用于工业；以淀粉水解液为原料，利用米曲霉发酵生成l-苹果酸，具有很高的产酸水平。两步发酵法是指先利用一种微生物将原料转化为富马酸，再利用另一种微生物将富马酸转化为l-苹果酸，先将根霉菌株接入培养基中培养，一段时间后再接入普通变形杆菌培养两天。该法需要两种微生物，培养条件较为严苛、发酵周期长、副产物多以及产酸率低。现阶段，酶法催化是指利用含有高富马酸酶活力的微生物细胞将富马酸转化为l-苹果酸，具有综合成本低、环保和工艺简单等优点，是工业化生产的主要技术。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生产l-苹果酸的双酶共表达菌株及其构建方法与应用。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种生产l-苹果酸的双酶共表达菌株，所述双酶共表达菌株为马来酸顺反异构酶与富马酸酶的共表达菌株。

4、本研究在单酶催化生产l-苹果酸的基础上，构建多酶催化系统，引入马来酸顺反异构酶，实现了以马来酸酐或马来酸盐为底物直接催化生产l-苹果酸。相比于以富马酸或富马酸盐为底物的单酶催化体系，多酶催化系统采用的底物马来酸酐或马来酸盐的成本更低，而且通过共表达策略，成功实现了“一菌双酶”表达，进一步降低了l-苹果酸的工业生产成本。

5、优选地，编码马来酸顺反异构酶基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的序列。

6、seq id no.1：

7、atgagcaaccactaccgtatcggtcagatcgttccgagcagcaacaccaccatggaaaccgaaatcccggcgatgctgggtgcgcgtcagctgatccgtccggaacgtttcaccttccacagcagccgtatgcgtatgaaacacgttaacaaagaagaactggcggcgatggatgcggaatccgatcgttgcgcgctggaactgtctgatgctcgtgttgatgttctgggctacgcgtgcctggttgcgatcatggcgatgggtctgggctaccaccgtgaaagccaggcgcgtctggcgcaggttaccaaagataaccaggcggcggcgccggtgatttctagcgcgggcgcgctggttaacggcctgaaagttatcggtgcaaaacgtatcgctctggttgcgccgtacatgaaaccgctgacccagctggttgttgattacatccagcacgaaggcatcgaagttaaagtttggcgtgcgctggaaatcccggacaacctggatgttggccgtcacgatccggcgcgtctgccgggtatcgttgcagaaatggatctgcgtgaagttgacgctatcgttctgagcgcgtgcgttcagatgccgagcctgccggcggttccgaccgttgaagcgcagaccggcaaaccggttatcaccgcggcgatcgcgaccacctacgcgatgctgaccgcgctggaactggaaccgatcgttccgggcgcgggtgcgctgctgagcggcgcgtactaa。

8、优选地，编码富马酸酶基因的核苷酸序列包括seq id no.2所示的序列。

9、seq id no.2：

10、atgaacaccgtccgttctgagaaggatagcatgggtgcgatcgacgtgcctgctgacaagctgtggggtgcacaaacgcaacgttctctggagcatttccgtatctccaccgagaagatgccgacttccctgatccacgcactggctctgactaagcgtgcagccgccaaagtcaacgaggacctgggtctgctgtctgaggaaaaagcgagcgctatccgtcaagcagctgacgaggtcctggcaggtcagcatgatgatgagttccctctggctatttggcagaccggttctggtactcagtctaacatgaacatgaatgaagtgctggcgaaccgcgctagcgaactgctgggcggtgtgcgtggtatggaacgtaaagtccacccgaacgacgacgtgaacaaaagccagtcctccaacgatgtgttcccgaccgcaatgcatgtggcggcgctgctggcgctgcgtaaacagctgattccacagctgaaaactctgactcagactctgaacgaaaaatcccgcgctttcgcggacatcgttaaaatcggccgcacccacctgcaggacgcaactccactgacgctgggtcaggagatttctggttgggtagctatgctggaacacaacctgaaacacattgaatacagcctgccgcacgtggcggaactggcactgggtggtaccgcagttggtaccggcctgaatacgcatccagaatacgctcgtcgtgtagctgatgaactggctgtaatcacctgcgcaccgttcgttaccgctccgaacaaattcgaagcgctggctacctgcgatgcactggttcaggctcatggtgctctgaaaggcctggctgcgtctctgatgaaaatcgcaaacgacgttcgttggctggcatctggtccgcgttgtggtatcggcgaaatttccatcccggaaaacgaaccgggctcttctatcatgccgggcaaagtgaacccgacccagtgtgaagcactgaccatgctgtgttgccaggttatgggtaacgacgtagcgatcaacatgggcggcgcgtctggcaattttgaactgaacgtttttcgcccgatggtaatccacaacttcctgcagtccgttcgcctgctggccgatggcatggaaagcttcaacaaacactgcgccgttggcatcgaaccgaaccgtgaacgtatcaaccagctgctgaatgaatccctgatgctggttacggcgctgaacacccacattggctacgataaggccgccgaaattgcgaaaaaagcgcacaaagaaggcctgaccctgaaagccgccgcgctggccctgggttatctgagcgaagcggaatttgatagctgggtacgcccggaacagatggttggctccatgaaagcgggccgctaa。

11、第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的生产l-苹果酸的双酶共表达菌株的构建方法，所述构建方法包括：

12、(1)以富马酸酶的编码基因为模板进行pcr，得到第一pcr产物；

13、载体prsfduet-1经限制性内切酶酶切，与得到的第一pcr产物连接，转入感受态细胞中，进行序列测定并提取质粒，得到连接产物；

14、以马来酸顺反异构酶的编码基因为模板进行pcr，得到第二pcr产物；

15、(2)将步骤(1)得到的连接产物经限制性内切酶酶切后，与第二pcr产物连接，转入感受态细胞中，进行序列测定并提取质粒，得到共表达载体；

16、(3)将共表达载体转入感受态细胞中。

17、优选地，步骤(1)所述限制性内切酶为bamhⅰ和ecorⅰ。

18、优选地，步骤(2)所述限制性内切酶为ndeⅰ和xhoⅰ。

19、优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述感受态细胞为dh5α。

20、优选地，步骤(3)中所述感受态细胞为bl21(de3)。

21、使用上述构建方法得到的共表达菌株，马来酸顺反异构酶和富马酸酶均有较高的酶活，可以应用于l-苹果酸的生产中。

22、第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的生产l-苹果酸的双酶共表达菌株的构建方法，所述构建方法包括：

23、(1)以马来酸顺反异构酶的编码基因为模板进行pcr，得到第一pcr产物；

24、载体pet-21a(+)经限制性内切酶酶切，与第一pcr产物连接，转入感受态细胞中，进行序列测定并提取质粒，得到连接产物；

25、以富马酸酶的编码基因为模板进行pcr，得到第二pcr产物；

26、(2)将步骤(1)得到的连接产物经限制性内切酶酶切后，与第二pcr产物连接，转入感受态细胞中，进行序列测定并提取质粒，得到共表达载体；

27、(3)将共表达载体转入感受态细胞中。

28、优选地，步骤(1)所述限制性内切酶为ndeⅰ和bamhⅰ。

29、优选地，步骤(2)所述限制性内切酶为ecorⅰ和xhoⅰ。

30、优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述感受态细胞为dh5α。

31、优选地，步骤(3)中所述感受态细胞为bl21(de3)。

32、使用上述构建方法得到的共表达菌株，马来酸顺反异构酶和富马酸酶均有较高的酶活，可以应用于l-苹果酸的生产中。

33、第四方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的生产l-苹果酸的双酶共表达菌株在l-苹果酸生产中的应用。

34、第五方面，本发明提供了一种l-苹果酸的生产方法，所述生产方法包括：将第一方面所述的生产l-苹果酸的双酶共表达菌株与底物混合，35-40℃震荡反应得l-苹果酸盐，经离子交换、浓缩、结晶、离心、干燥即得l-苹果酸；例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

35、使用本方法生产l-苹果酸，实现了以马来酸盐为底物直接催化生产l-苹果酸，且中间产物富马酸残留很低，进一步降低了生产成本，具有较高的l-苹果酸转化率。

36、优选地，所述底物为马来酸、马来酸酐或马来酸盐中的任意一种或至少两种的组合。

37、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

38、本研究在单酶催化生产l-苹果酸的基础上，构建多酶催化系统，引入马来酸顺反异构酶，实现了以马来酸酐或马来酸盐为底物直接催化生产l-苹果酸。相比于以富马酸或富马酸盐为底物的单酶催化体系，多酶催化系统采用的底物马来酸酐或马来酸盐成本更低，而且通过共表达策略，成功实现了“一菌双酶”表达，进一步降低了l-苹果酸的工业生产成本。