1.本发明属于生物学中细胞培养装置技术领域，具体涉及一种深孔细胞培养板、制备方法及其应用。
背景技术：
2.深孔板用于处理、转移和储藏液体样品，目前广泛用于生物领域如细胞培养等；用于极性有机溶液、酸性和碱性溶液等实验室液体的贮存；用于鉴定系统的母板取样及存样、机械取样和自动移液系统；用于自动稀释器、加样器；用于血液凝集反应，抗体滴度的测定。各种不同的领域对环境的要求不同，这就要求深孔板具有良好的耐受性、耐温性、机械强度大等。现有技术中的深孔板结构的方孔上部容易发生样品残留或毛细现象，导致样品损失过多或交叉感染。当前市面上深孔板制作主要用聚丙烯材料，聚丙烯材料因其非极性，呈现疏水特性。对聚丙烯改性使用最多的方法是共混熔融改性，通过小分子亲水添加剂共混，在经热加工后，亲水小分子与聚丙烯材料相容性差，会迁移到材料表面，因而增强聚丙烯的表面亲水性，但由于高温加工时材料易产生热分解、变黄和力学性能降低等问题。其次是表面涂层改性的方案，这种方法通常采用有机硅涂层，比如硅烷偶联剂，同样有进入溶液体系污染的问题，且工艺繁琐，有过程污染风险，批量生产效应低，生产成本高。
技术实现要素：
3.本发明的目的在于提供一种深孔细胞培养板、制备方法及其应用，该深孔细胞培养板具有更优的表面亲水性能，且亲水时效性得到进一步改善，使用寿命明显增加；同时也进一步改善了细胞培养板的力学性能，韧性得到提升。
4.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种深孔细胞培养板，包括基础深孔细胞板以及表面修饰的化合物；上述化合物通过化学键键连至深孔细胞板表面；上述化合物包括己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物；上述衣康酸衍生物包括乙基肼衍生衣康酸的产物；上述深孔细胞板表面的化合物接枝率＞0.4%。本发明采用己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物对经过氩氧混合低温等离子体活化的深孔细胞板表面进行接枝改性，能够有效改善深孔细胞培养板表面的亲水性能，其水接触角明显增加；且其亲水时效性得到显著的提升，产品在空气中放置两个月仍然具有优异的亲水性能，有效延长使用寿命。同时，深孔细胞板表面接枝处理后，其力学性能得到一定提升，尤其冲击强度具有显著的增加。其原因可能在于，本发明先采用等离子体对深孔细胞板表面进行活化处理，然后采用己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物进行接枝修饰，在培养板表面引入更多的极性官能团，赋予材料新的物理、化学性能，使得深孔细胞培养板表面表现出更佳的亲水性，生物相容性得到改善；己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物通过化学键连接在板材表面，结合力明显增强，且在两者同时存在的条件下，协同复配，更好地附着在培养板表面，进一步延长培养板表面的亲水时效性，同时力学性能得到增强。
5.在具体实施例中，化合物通过固相浸润接枝的方法修饰至深孔细胞板表面。
6.在具体实施例中，衣康酸衍生物的化学结构如式i所示：i。
7.本发明还公开了衣康酸衍生物的制备方法，包括：采用乙基肼与衣康酸酐通过酰胺化反应制备获得衣康酸衍生物。
8.进一步的，上述衣康酸衍生物的制备方法，具体包括：取衣康酸酐加入三氯甲烷溶解，浓度为0.2~0.3g/ml，水浴加热至20~30℃，然后缓慢加入浓度为0.5~1g/ml的乙基肼-三氯甲烷溶液，滴加完毕后恒温反应30~60min，之后冷却结晶，减压抽滤，产物用三氯甲烷重结晶、减压蒸馏、干燥得到衣康酸衍生物。
9.在具体实施例中，衣康酸酐与乙基肼的摩尔比为1~1.2:1。
10.本发明还公开了上述深孔细胞培养板的制备方法，包括：预处理，取深孔细胞板置于超声波条件下依次采用蒸馏水、丙酮进行清洗得到预处理的深孔细胞板；等离子体活化，采用ar/o2混合低温等离子体对预处理的深孔细胞板表面进行活化处理得到活化的深孔细胞板；接枝处理，取活化的深孔细胞板浸润于包含己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物的水溶液中进行处理，接枝得到深孔细胞培养板。
11.具体的，上述深孔细胞培养板的制备方法，包括：预处理，取深孔细胞板置于超声波条件下蒸馏水洗20~40min，丙酮超声洗20~40min，之后70~80℃下真空干燥10~20min；等离子体活化，将预处理的深孔细胞板放入射频等离子体系中的等离子体反应室里，按照顺序开启机械泵和罗茨泵，待反应室中的工作气压至10-3
pa时，设定工艺参数；处理完成后取出样品得到活化的深孔细胞板；接枝处理，预先配制包含己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物的水溶液，加热至60~70℃，然后加入等离子体活化后的深孔细胞板中使其浸没深孔细胞板的待修饰部位，采用固相浸润接枝的方法在深孔细胞板待修饰部位表面接枝化合物，浸润时间为2~4min，取出后用水清洗2~5次、烘干后得到深孔细胞培养板。
12.在具体实施例中，ar/o2混合低温等离子体工艺参数，包括：ar/o2流量比为38~40/10~13sccm，处理时间4~6min，功率280~320w，工作气压75~85pa。
13.在具体实施例中，水溶液中己二烯酒石酸二胺的浓度为40~45wt%。
14.在具体实施例中，水溶液中衣康酸衍生物的浓度为20~25wt%。
15.在具体实施例中，水溶液由水/丙酮混合溶液替代。
16.优选地，上述水/丙酮混合溶液还加入3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸。本发明在深孔细胞板表面接枝处理过程中加入3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸，能够起到一定的界面活性剂的作用，更好地促进接枝化合物在深孔细胞板表面的接枝过程，明显增加化合物的接枝率，进而对深孔细胞培养板表面的形貌结构产生有益的改变，从而有效提升深孔细胞培养板的亲水性和力学性能。
17.在具体实施例中，3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸加入量为0.01~0.02mol/l；丙酮与水的体积比为0.8~1.4:1。
18.更优选地，深孔细胞板表面的化合物接枝率＞0.7%。
19.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明采用己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物对经过氩氧混合低温等离子体活化的深孔细胞板表面进行接枝改性，能够有效改善深孔细胞培养板表面的亲水性能，其水接触角明显增加；且其亲水时效性得到显著的提升，有效延长使用寿命。同时，深孔细胞板表面接枝处理后，其力学性能得到一定提升，尤其冲击强度具有显著的增加。本发明在深孔细胞板表面接枝处理过程中加入3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸，能够明显增加化合物的接枝率，进而对深孔细胞培养板表面的形貌结构产生有益的改变，从而有效提升深孔细胞培养板的亲水性和力学性能。
20.因此，本发明提供了一种深孔细胞培养板、制备方法及其应用，该深孔细胞培养板具有更优的表面亲水性能，且亲水时效性得到进一步改善，使用寿命明显增加；同时也进一步改善了细胞培养板的力学性能，韧性得到提升。
附图说明
21.图1是本发明实施例1中制备的活化的深孔细胞板以及深孔细胞培养板的红外测试结果。
具体实施方式
22.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本技术而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本技术所要求保护的技术方案。
23.本发明实施例所用深孔细胞板材质为聚丙烯。
24.实施例1：深孔细胞培养板的制备：预处理，取深孔细胞板置于超声波条件下蒸馏水洗35min，丙酮超声洗35min，之后76℃下真空干燥15min；等离子体活化，将预处理的深孔细胞板放入射频等离子体系中的等离子体反应室里，按照顺序开启机械泵和罗茨泵，待反应室中的工作气压至10-3
pa时，设定工艺参数，包括：ar/o2流量比为39/11sccm，处理时间4.5min，功率295w，工作气压82pa；处理完成后取出样品得到等离子体活化后的深孔细胞板；接枝处理，预先配制包含己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物的水溶液（其中，己二烯酒石酸二胺的浓度为43wt%，衣康酸衍生物的浓度为23wt%），加热至65℃，然后加入等离子体活化后的深孔细胞板中使其浸没深孔细胞板的待修饰部位，采用固相浸润接枝的方法在深孔细胞板待修饰部位表面接枝化合物，浸润时间为3min，取出后用水清洗4次、烘干后得到深孔细胞培养板。
25.上述衣康酸衍生物的制备：
取衣康酸酐加入三氯甲烷溶解，浓度为0.25g/ml，水浴加热至28℃，然后缓慢加入浓度为0.8g/ml的乙基肼-三氯甲烷溶液（衣康酸酐与乙基肼的摩尔比为1.15:1），滴加完毕后恒温反应45min，之后冷却结晶，减压抽滤，产物用三氯甲烷重结晶、减压蒸馏、干燥得到衣康酸衍生物（其化学结构如下所示）。1h nmr(500 mhz, d2o) δ 6.82、5.93(2h, c=ch2), 2.84 (s, 2h, o=c-ch2), 2.52 (m, 2h,
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ch2), 1.09 (t, 3h,
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ch3)。
26.实施例2：深孔细胞培养板的制备与实施例1的区别在于：等离子体活化工艺参数，包括：ar/o2流量比为38/10sccm，处理时间4min，功率320w，工作气压75pa；水溶液中己二烯酒石酸二胺的浓度为40wt%，衣康酸衍生物的浓度为20wt%。
27.衣康酸衍生物的制备同实施例1。
28.实施例3：深孔细胞培养板的制备与实施例1的区别在于：等离子体活化工艺参数，包括：ar/o2流量比为40/12sccm，处理时间5min，功率280~320w，工作气压85pa；水溶液中己二烯酒石酸二胺的浓度为45wt%，衣康酸衍生物的浓度为25wt%。
29.衣康酸衍生物的制备同实施例1。
30.实施例4：深孔细胞培养板的制备与实施例1的区别在于：等离子体活化工艺参数，包括：ar/o2流量比为40/10sccm，处理时间5.5min，功率310w，工作气压80pa；水溶液中己二烯酒石酸二胺的浓度为44wt%，衣康酸衍生物的浓度为22wt%。
31.衣康酸衍生物的制备同实施例1。
32.实施例5：深孔细胞培养板的制备与实施例1的区别在于：接枝处理过程中，水溶液中采用同等摩尔量的己二烯酒石酸二胺替代衣康酸衍生物。
33.实施例6：深孔细胞培养板的制备：预处理，取深孔细胞板置于超声波条件下蒸馏水洗35min，丙酮超声洗35min，之后76℃下真空干燥15min；等离子体活化，将预处理的深孔细胞板放入射频等离子体系中的等离子体反应室里，按照顺序开启机械泵和罗茨泵，待反应室中的工作气压至10-3
pa时，设定工艺参数，包括：ar/o2流量比为39/11sccm，处理时间4.5min，功率295w，工作气压82pa；处理完成后取出样品得到等离子体活化后的深孔细胞板；
接枝处理，预先配制包含己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物的水/丙酮溶液（其中，己二烯酒石酸二胺的浓度为43wt%，衣康酸衍生物的浓度为23wt%；丙酮与水的体积比为1:1），加入3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸（加入量为0.015mol/l），加热至65℃，然后加入等离子体活化后的深孔细胞板中使其浸没深孔细胞板的待修饰部位，采用固相浸润接枝的方法在深孔细胞板待修饰部位表面接枝化合物，浸润时间为3min，取出后用水清洗4次、烘干后得到深孔细胞培养板。
34.衣康酸衍生物的制备同实施例1。
35.实施例7：深孔细胞培养板的制备：预处理，取深孔细胞板置于超声波条件下蒸馏水洗35min，丙酮超声洗35min，之后76℃下真空干燥15min；等离子体活化，将预处理的深孔细胞板放入射频等离子体系中的等离子体反应室里，按照顺序开启机械泵和罗茨泵，待反应室中的工作气压至10-3
pa时，设定工艺参数，包括：ar/o2流量比为39/11sccm，处理时间4.5min，功率295w，工作气压82pa；处理完成后取出样品得到等离子体活化后的深孔细胞板；接枝处理，预先配制包含己二烯酒石酸二胺和衣康酸衍生物的水/丙酮溶液（其中，己二烯酒石酸二胺的浓度为43wt%，衣康酸衍生物的浓度为23wt%；丙酮与水的体积比为1:1），加热至65℃，然后加入等离子体活化后的深孔细胞板中使其浸没深孔细胞板的待修饰部位，采用固相浸润接枝的方法在深孔细胞板待修饰部位表面接枝化合物，浸润时间为3min，取出后用水清洗4次、烘干后得到深孔细胞培养板。
36.衣康酸衍生物的制备同实施例1。
37.实施例8：深孔细胞培养板的制备与实施例6的区别在于：接枝处理过程中，水溶液中采用同等摩尔量的己二烯酒石酸二胺替代衣康酸衍生物。
38.对比例1：深孔细胞培养板的制备：预处理，取深孔细胞板置于超声波条件下蒸馏水洗35min，丙酮超声洗35min，之后76℃下真空干燥15min；等离子体活化，将预处理的深孔细胞板放入射频等离子体系中的等离子体反应室里，按照顺序开启机械泵和罗茨泵，待反应室中的工作气压至10-3
pa时，设定工艺参数，包括：ar/o2流量比为39/11sccm，处理时间4.5min，功率295w，工作气压82pa；处理完成后取出样品得到等离子体活化后的深孔细胞板。
39.试验例1：红外表征测试采用傅里叶变换红外光谱仪进行。波数范围4000~500cm-1
。
40.对实施例1中制备的活化的深孔细胞板以及深孔细胞培养板进行上述测试，结果如图1所示。从图中分析可知，相比于活化的深孔细胞板的红外测试结果，在深孔细胞培养板的红外光谱中，3250cm-1
~3400cm-1
范围内出现n-h键的特征吸收峰，在1670cm-1
、1538cm-1
附近出现酰胺基团特征吸收峰，以上结果表明实施例1中深孔细胞培养板成功制备。
41.试验例2：亲水性能测定接触角测量，取待测样品置于静态接触角测量仪载物台，固定压紧，然后用微量进样器取5μl去离子水，滴于样品表面，10s后对表面水滴形态进行拍摄，之后采用软件处理对液滴与样品表面接触角进行测量，实验中重复测试5次取平均值。
42.亲水性能时效性将制备得到的样品放置于空气（25
±
3℃、50%湿度）中60d，在此测定表面的接触角，计算接触角增加率，表征样品亲水时效性。
43.对实施例1-8、对比例1制备的深孔细胞培养板进行上述测试，结果如表1所示：表1 亲水性能测试结果样品接触角/
°
接触角增加率/%对比例137200.8实施例1262.9实施例2252.8实施例3263.0实施例4252.9实施例53320.4实施例6182.7实施例7232.8实施例82719.9从表1中的数据分析可知，实施例1制备的深孔细胞板的表面水接触角明显低于实施例5的和对比例1的，且在空气中放置60d之后，表面水接触角增加率明显低于实施例5和对比例1的，实施例5的效果好于对比例1的，表明采用衣康酸衍生物对深孔细胞板进行化学接枝修饰，能够有效改善深孔细胞培养板表面的亲水性能，并且能够有效提升表面亲水时效性，延长产品使用寿命；同时在己二烯酒石酸二胺共同存在的条件下，对深孔细胞培养板表面的亲水性的增强效果更佳。实施例6制备的深孔细胞板的表面水接触角明显低于实施例7的，实施例7的效果稍好于实施例1的，实施例8的效果好于实施例5的，表明在接枝处理过程中加入3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸，能够进一步增加深孔细胞培养板表面的亲水性能。
44.试验例3：冲击性能测定测试方法参考gb/t 1843《塑料悬臂梁冲击试验方法》规定的进行。
45.对实施例1-8、对比例1制备的深孔细胞培养板进行上述测试，结果如表2所示：表2 冲击性能测试结果样品冲击强度（kj/m2）对比例17.74实施例19.46实施例29.48
实施例39.35实施例49.50实施例58.13实施例610.27实施例79.89实施例88.92从表2中的数据分析可知，实施例1制备的深孔细胞板的冲击强度明显高于实施例5的和对比例1的，实施例5的效果好于对比例1的，表明采用衣康酸衍生物对深孔细胞板进行化学接枝修饰，能够有效增强深孔细胞培养板的冲击强度，改善深孔细胞培养板的韧性；同时在己二烯酒石酸二胺共同存在的条件下，对深孔细胞培养板韧性的增强效果更佳。实施例6制备的深孔细胞板的冲击强度明显高于实施例7的，实施例7的效果稍好于实施例1的，实施例8的效果好于实施例5的，表明在接枝处理过程中加入3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸，能够进一步增加深孔细胞培养板的冲击强度。
46.试验例4：对实施例1-8、对比例1制备的深孔细胞培养板的接枝率进行测试，结果如表3所示：表3 接枝率测试结果样品接枝率（%）对比例10.45实施例10.47实施例20.46实施例30.45实施例40.46实施例50.45实施例60.73实施例70.54实施例80.50从表3中的数据分析可知，实施例1制备的深孔细胞板的接枝率与实施例5以及对比例1的相当，实施例5的效果与对比例1的相当，表明采用衣康酸衍生物对深孔细胞板进行化学接枝修饰，对深孔细胞培养板的接枝率不产生消极影响。实施例6制备的深孔细胞板的接枝率明显高于实施例7的，实施例7的效果稍好于实施例1的，实施例8的效果好于实施例5的，表明在接枝处理过程中加入3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸，能够有效提升化合物接枝于深孔细胞培养板的接枝率。
47.上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
48.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。