一种基于西瓜嗜酸菌T6SS的基因工程菌及其应用

本发明涉及生物工程，具体涉及一种基于西瓜嗜酸菌t6ss的基因工程菌及其应用，尤其涉及一种依赖细菌t6ss的绿色杀菌方法的菌株改造及其应用。

背景技术：

1、解决农作物病虫害问题的迫切需要，导致化学农药大量施用，衍生出病原菌抗药性日趋严重、农药残留和生态破坏等诸多问题。因此在深入研究病虫害发生规律、大力加强培育抗病虫品种的同时，探索新型生物防治方法，减少化学农药使用量具有战略性和紧迫性，是发展绿色农业的必经之路。近年来新型生物防治方法引起研究者极大重视，探索出纳米技术、噬菌体防治技术、微生物组技术等新型防治方法，但由于不同方法本身的诸多限制，技术应用均尚不成熟。

2、t6ss是细菌攻击其它微生物最有力的“武器”，最早于2006年在霍乱弧菌和铜绿假单胞菌中发现。随着对t6ss结构和功能研究的深入，现已在多种革兰氏阴性细菌中发现t6ss的存在并报道，且证实其在微生物种间互作及微生物与寄主互作过程中发挥重要功能，但对其生防作用有待于开发， 因此本发明主要研究基于细菌t6ss的新型绿色杀菌方法。经生物信息学预测，西瓜嗜酸菌基因组中有多个编码t6ss的基因簇，包括含有18个基因的大基因簇和13个含有vgrg或paar的小基因簇，并对14个编码t6ss的基因簇内部及临近基因可能存在的依赖t6ss的效应蛋白进行预测，得到共17个潜在的效应蛋白编码基因。对西瓜嗜酸菌t6ss进行失活和对预测效应蛋白编码基因逐一敲除，通过分泌实验和杀菌实验证实西瓜嗜酸菌t6ss具有分泌活性，且对多种细菌和真菌具有杀菌活性，特别是对细胞壁较厚的革兰氏阳性细菌，这在细菌中非常少见，研究进一步证实该细菌t6ss在植物体内仍能行使杀菌功能。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供一种基于西瓜嗜酸菌t6ss的基因工程菌及其应用。西瓜嗜酸菌是一种重要的植物病原细菌， 能够侵染多种葫芦科作物引起细菌性果斑病； 其t3ss对致病性起决定作用， 因此本发明对该病原菌进行遗传改造，使其t3ss完全失活， 同时保留其t6ss及其杀菌功能，对植物病害进行生物防治。

2、本发明的技术方案如下：

3、第一方面：

4、本发明提供一种基因工程菌的构建方法，所述方法是在野生型西瓜嗜酸菌aac00-1的基础上使hrcc基因缺失，制备得到所述基因工程菌。

5、在野生型西瓜嗜酸菌aac00-1的基础上使hrcc基因缺失的方法包括如下步骤：

6、步骤1、分别扩增hrcc基因的上游基因片段和下游基因片段；其中，上游基因片段的序列如seq id no.1所示； 下游基因片段的序列如seq id no.2所示；

7、步骤2、将扩增的上游基因片段和下游基因片段连接至pk18mobsacb自杀载体上，使用接合转移的方式导入所述野生型西瓜嗜酸菌aac00-1的菌体中，利用sacb使用蔗糖进行反选，得到hrcc基因缺失菌株， 即得t3ss失活的工程菌株。

8、步骤1中，扩增所述上游基因片段的引物为：

9、f：gattacgaattcgagctcgggtgagcgaaaggtgcttcac，如seq id no.3所示；

10、r：gcccaaaatttccgcgaggttcgcaagccatga，如seq id no.4所示。

11、步骤1中，扩增所述下游基因片段的引物为：

12、f：tggcttgcgaacctcgcggaaattttgggcatc，如seq id no.5所示；

13、r：agtcacgacgttgtaaaacgatattcgtgcagcgcgtagtt，如seq id no.6所示。

14、第二方面，本发明还提供一种如上所述的制备方法制备获得的基因工程菌。

15、第三方面，本发明还提供一种包括如上所述的基因工程菌的杀菌剂。

16、第四方面，本发明还提供一种如上所述的基因工程菌在动物病原细菌和植物病原细菌防治中的应用。

17、第五方面，本发明还提供一种如权利要求5所述的基因工程菌在pxo99a侵染水稻所致的水稻白叶枯病害中的应用。

18、第六方面，本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒通过以下方法构建所得：

19、扩增hrcc基因的上游基因片段和下游基因片段；将扩增的上游基因片段和下游基因片段连接至pk18mobsacb自杀载体上， 即得所述重组质粒。

20、扩增所述上游基因片段的引物为：

21、f：gattacgaattcgagctcgggtgagcgaaaggtgcttcac，如seq id no.3所示；

22、r：gcccaaaatttccgcgaggttcgcaagccatga，如seq id no.4所示。

23、扩增所述下游基因片段的引物为：

24、f：tggcttgcgaacctcgcggaaattttgggcatc，如seq id no.5所示；

25、r：agtcacgacgttgtaaaacgatattcgtgcagcgcgtagtt，如seq id no.6所示。

26、第七方面，本发明还提供一种细菌ⅵ型分泌系统，包括如下t6ss效应蛋白编码基因中的多种：

27、aave_0239、aave_0483、aave_0499、aave_2049、aave_2130、aave_2740、aave_2838、aave_3345、aave_3478、aave_3481、aave_3751、aave_3788、aave_3794、aave_3796、aave_4008、aave_4283、aave_4290。

28、本发明所述的细菌ⅵ型分泌系统(type ⅵ secretion system，t6ss)，含有至少13个保守核心组件蛋白，分别为：跨膜复合体(tssjlm)，基座复合体(tssefgk)和细胞内双层管状结构(外鞘蛋白tssb/c或vipa/b， 内管蛋白hcp)。t6ss的内管蛋白hcp及其尖端的vgrg和paar蛋白均可通过共价或非共价的方式结合具有抗菌作用的t6ss效应蛋白。外鞘蛋白通过收缩可以驱动运载效应蛋白的内管和尖端复合物穿过细胞膜将效应蛋白注射进临近细胞，从而产生杀菌或抑菌作用。而具有ⅵ型分泌系统的细菌本身由于效应蛋白下游含有与之对应的免疫蛋白，因此可以免受其害。本发明对具有强杀菌效果的病原菌西瓜嗜酸菌进行遗传改造，得到ⅲ型分泌系统(type ⅲ secretion system，t3ss)失活的西瓜嗜酸菌aac00-1t3ss-，使其不具有致病性但原有依赖t6ss杀菌活性不受影响。从而使其在保留原有杀菌活性的前提下保证在其应用过程中的生态安全。

29、所述的细菌ⅵ型分泌系统为西瓜嗜酸菌ⅵ型分泌系统，共由14个基因簇编码，其中含17个潜在的效应蛋白。其t6ss在28℃和37℃均有很强的杀菌活性，且随自身生长在od600＝0.8-2.0范围内均有稳定的较强的分泌活性。

30、所述的西瓜嗜酸菌ⅵ型分泌系统对多种动物病原细菌和植物病原细菌均具有强杀菌活性。

31、所述的西瓜嗜酸菌ⅵ型分泌系统对引起水稻白叶枯的病原细菌xanthomonasoryzaepv. oryzae pxo99a不仅在离体条件下具有高效杀菌活性，在水稻植株体内也具有显著抑菌活性，且能有效减少病害的发生。使用本发明所构建突变菌株与病原细菌混合液浸润接种水稻叶片时，7天后没有明显发病症状，而接种病原细菌的阳性处理组接种2天后即可观察到明显的发病症状。使用本发明所构建突变菌株与病原细菌混合液使用剪叶法接种水稻叶片时在接种13天后与阴性对照没有明显差异，而阳性对照组接种叶片全部干枯。因此，本发明所构建菌株在植物病害生物防治领域具有巨大的潜在应用价值。

32、本发明构建了用于绿色防控的工程菌株aac00-1t3ss-，由于该菌野生型菌株为重要致病菌，因此通过同源重组的方式敲除其t3ss结构基因hrcc，使其t3ss完全失活，丧失对寄主植物的致病性，保证其使用过程中的生态安全。

33、本发明提供了一种基于细菌t6ss的新型杀菌方法，实验结果表明，本发明所得到的新型方法对多种病原细菌均有显著杀菌效果，其中包括重要的动物病原细菌和植物病原细菌，在28℃和37℃均有杀菌活性，且随自身生长在od600＝0.8-2.0范围内均有稳定的较强的分泌活性。

34、本发明中基于西瓜嗜酸菌t6ss的新型杀菌方法对接种重要植物病原细菌xanthomonas oryzae pv. oryzae的水稻秧苗具有保护作用，可用于水稻白叶枯早期病害的生物防治。