一种甲型流感病毒核酸检测试剂、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及一种甲型流感病毒核酸检测试剂及试剂盒，属于体外诊断试剂。

背景技术：

1、甲型流感是最常见的季节性流感（seasonal influenza），其病原体为甲型流感病毒，其为目前全球活动的主要流感病毒。甲型流感病毒属于正粘病毒科（orthomyxoviridae），根据其表面抗原ha（haemagglutinin，血凝素）和na（neuraminidase，神经氨酸酶）的抗原特性和序列特征可分为多种亚型，包括ha的18种抗原亚型（h1~h18）、na的11种抗原亚型（n1~n11）。甲型流感病毒易变异，其编码ha和（或）na的核苷酸序列容易发生突变，从而导致ha和（或）na的抗原表位发生变化，致使人群原有的特异性免疫力失效，形成甲型流感传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行的特点。虽然流感具有自限性，但对免疫力低下人群（如幼儿、孕妇和老年人等）仍可能造成致命危害。如果在流感发病后24~48小时内给予抗病毒治疗，可有效对抗流感。因此，甲型流感的早期快速精确诊断对于及时干预治疗和控制疾病的传播至关重要。

2、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，简称lamp）技术是一种核酸扩增新方法，针对目标基因的6个或8个区域设计4种或6种引物，在链置换dna聚合酶的作用下以恒定温度进行反应。lamp反应扩增效率极高，在15~60min内便可以达到109~1010个数量级的扩增，可有效缩短检测时长。传统的流感病毒的检测手段，如血清学检测和抗原检测，虽然时间短、要求低，但灵敏度低，容易造成假阳性。荧光定量pcr检测方法虽然灵敏度较高，但存在仪器（荧光定量pcr仪）和场所（专业实验室和检测人员）限制，不利于推广。lamp技术仅使用恒温就可高效扩增核酸，简化了对仪器和场所的需求，可应用于快速诊断。

3、现有技术中，中国专利cn113106089a，公开了一种使用lamp技术检测甲型流感的引物探针组合及恒温扩增试剂盒，其检测灵敏度为500 copies/ml；中国专利cn101818207a公开了一种包含甲型流感h1n1检测的引物探针及试剂盒，但该专利仅能检测h1n1亚型的流感病毒，且检测限为7750 copies/ml。因此，为了实现甲型流感的早期快速精确诊断和及时治疗，需进一步提高检测灵敏度。

技术实现思路

1、本发明为了解决现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供了一种甲型流感病毒核酸检测试剂及试剂盒，能对甲型流感病毒进行快速检测，且灵敏度高。

2、为解决上述技术问题，本发明的第一个目的是，提供一种用于检测甲型流感病毒靶标序列的引物组合在制备甲型流感病毒核酸检测试剂中的应用。本发明选择甲型流感病毒序列中高度保守的基质蛋白（matrix protein 1，后简称m1）的编码区cds序列作为靶标序列，公开了该引物组合的序列。具体地，所述靶标序列为甲型流感病毒m1基因上cds区域中第79-338位核苷酸序列，其中，f3区为第79-101位核苷酸序列，f2区为第122-143位核苷酸序列，f1区为第173-196位核苷酸序列，b1c区为第221-242核苷酸序列，b2c区为第276-297核苷酸序列，b3c区为第317-338位核苷酸序列；

3、引物组合包括外引物对flua f和fluab、内引物对flua fip和flua bip以及环引物对flua lf和flua lb，其中，flua f具有与f3区相同的核苷酸序列，flua b具有与b3c区反向互补的核苷酸序列；flua fip具有f1区反向互补的核苷酸序列以及与f2区相同的核苷酸序列，flua bip具有与b1c区相同的核苷酸序列以及与b2c区反向互补的核苷酸序列；环引物对flua lf和位于f2区位和f1区之间的第148-168的核苷酸序列反向互补、flua lb和位于b1c区和b2c区之间的第250-261位的核苷酸序列相同。

4、进一步，外引物对flua f和fluab的碱基序列分别如seq idno:1-2所示：

5、flua f:5’-agacttgargatgtctttgctgg-3’,

6、flua b: 5’-ttggccccatggaatgttatct-3’;

7、内引物对fip和bip的碱基序列分别如seq id no:3-4所示：

8、fluafip: 5’-gcgtgaacacaaayccyaagatycctctcatggaatggctaaagac-3’,

9、fluabip: 5’-tgcagcgtagacgctttgtycacagtttaactgcyytrtccatg-3’

10、环引物对flualf和flua lb的碱基序列如seq id no:5-6所示:

11、flua lf: 5’-agtcagaggtgacargattgg-3’,

12、flua lb: 5’-ctcaatgggaatggggaycc-3’;

13、其中，fluafip的5’端标记有fitc或fam基团、flua lf的5’端标记有生物素biotin，或者flua fip的5’端标记有fitc或fam基团、flua lb的5’端标记有生物素biotin，或者flua bip的5’端标记有fitc或fam基团、flua lb的5’端标记有生物素biotin。

14、作为本发明的第二个目的，提供一种用于甲型流感病毒核酸检测的试剂，至少包括用于检测甲型流感病毒靶标序列的引物组合；其中，所述靶标序列为甲型流感病毒m1基因上cds区域中第79-338位核苷酸序列，其中，f3区为第79-101位核苷酸序列，f2区为第122-143位核苷酸序列，f1区为第173-196位核苷酸序列，b1c区为第221-242核苷酸序列，b2c区为第276-297核苷酸序列，b3c区为第317-338位核苷酸序列；

15、引物组合包括外引物对flua f和fluab、内引物对flua fip和flua bip以及环引物对flua lf和flua lb，其中，flua f具有与f3区相同的核苷酸序列，flua b具有与b3c区反向互补的核苷酸序列；flua fip具有f1区反向互补的核苷酸序列以及与f2区相同的核苷酸序列，flua bip具有与b1c区相同的核苷酸序列以及与b2c区反向互补的核苷酸序列；环引物对flua lf和位于f2区位和f1区之间的第148-168的核苷酸序列反向互补、flua lb和位于b1c区和b2c区之间的第250-261位的核苷酸序列相同。

16、进一步，外引物对flua f和fluab的碱基序列分别如seq idno:1-2所示：

17、flua f:5’-agacttgargatgtctttgctgg-3’,

18、flua b: 5’-ttggccccatggaatgttatct-3’;

19、内引物对fip和bip的碱基序列分别如seq id no:3-4所示：

20、fluafip: 5’-gcgtgaacacaaayccyaagatycctctcatggaatggctaaagac-3’,

21、fluabip: 5’-tgcagcgtagacgctttgtycacagtttaactgcyytrtccatg-3’

22、环引物对lf和lb的碱基序列如seq id no:5-6所示:

23、flua lf: 5’-agtcagaggtgacargattgg-3’,

24、flua lb: 5’-ctcaatgggaatggggaycc-3’;

25、其中，fluafip的5’端标记有fitc或fam基团、flua lf的5’端标记有生物素biotin，或者flua fip的5’端标记有fitc或fam基团、flua lb的5’端标记有生物素biotin，或者flua bip的5’端标记有fitc或fam基团、flua lb的5’端标记有生物素biotin。

26、作为本发明的第三个目的，本技术提供一种甲型流感病毒核酸检测试剂盒，包括权利要求上述的用于甲型流感病毒核酸检测的试剂。

27、进一步，所述核酸检测试剂盒还包括环介导等温扩增反应液和检测卡。

28、进一步，所述环介导等温扩增反应液包括等温扩增缓冲液、dntp、bstdna聚合酶，逆转录酶。

29、进一步，等温扩增缓冲液包括tris-hcl、 (nh4)2so4、kcl、mgso4、tween-20。

30、进一步，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；底板为pvc板；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为：c线、t线，其中c线包被biotin-bsa，t线包被兔抗fam抗体。

31、进一步，所述biotin-bsa的浓度为3.2mg/ml，兔抗fam抗体的浓度为0.15mg/ml。

32、作为本发明的第四个目的，本技术提供了上述的试剂或试剂盒在甲型流感病毒非疾病类诊断中的应用。

33、本发明所达到的有益技术效果：本技术以m1基因上cds区域中第79-338位核苷酸序列作为靶标序列，制备出的甲型流感病毒检测试剂或试剂盒，灵敏度高，从试验数据看出，检测限低至100 copies/ml，可以初期就能检测出患者的感染情况，便于临床上在患病前期就进行医学干预；结合胶体金层析技术，检测过程无需借助其他仪器，结果直观，判读简单，而且成本低，适合在基层医疗单位推广。