一种尾巨桉DH3213的遗传转化方法与流程

本发明属于植物转基因，具体涉及一种尾巨桉dh3213的遗传转化方法。

背景技术：

1、桉树是是桃金娘科(myrtaceae)桉属(eucalyptus)、杯果木属(angophora)和伞房属(corymbia)植物的总称，原产澳大利亚及其附近岛屿。因生长迅速、适应性好、木材质量好，可用作高质量纸浆生产、木材、薪材和精油等。桉树目前在我国的热带和亚热带地区广泛种植，栽培面积达546.74万公顷。

2、植物基因工程技术在林业中的应用，弥补了常规育种周期长、定向改良难以控制、远缘杂交或物种间杂交几乎难以实现的困难和不足，为树木遗传改良和林木新品种培育提供了很好的途径。目前，绝大多数植物都是通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因植株，稳定高效的遗传转化体系建立成为开展林木转基因育种和基因功能验证体系的先决条件。由于桉树的重要性，已成功建立细叶桉、巨尾桉、柳叶桉和赤桉等多个桉树的遗传转化体系。部分也获得了抗虫和耐除草剂、木质素降低、耐冷、抗盐、抗青枯病和早花的转基因植株。但这些研究主要是以有性材料或者非栽培种为基础。而我国南方主要栽培的栽培良种仍难以突破再生困难的瓶颈，难以建立有效的遗传转化体系，无法开展桉树良种的转基因和基因编辑新种质的培育研究。同时已经建立起的桉树遗传转化体系存在着转化周期长，整个流程需要4-6个月，影响开展基因功能鉴定和新种质的培育。

3、在华南地区栽培的尾巨桉良种dh3213是广西东门林场选育的尾叶桉和巨桉的杂交种，在广东、广西多点试验中都表现出生长速度快、出材率高，其年平均胸径生长量达到3.1cm，年平均树高生长量为4.4m，年平均蓄积生长量为32.8m3/hm2，干形通直圆满，长势旺盛，属于造纸性能良好的速生无性系。以此良种为材料开展进一步的转基因和基因编辑育种，可以保持其良好性状的基础上引入新的性状如抗虫、抗除草剂等，获得新的种质，满足桉树生产中的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对目前我国华南地区主要桉树栽培良种没有遗传转化体系，无法开展基因工程改良和基因编辑技术的应用问题，以及目前桉树缺少稳定、高效的遗传转化体系的问题；本发明对于栽培良种尾巨桉dh3213提供了一种根癌农杆菌介导的遗传转化方法，为对其进一步改良提供基础，方法易行，快速、高效。

2、本发明以我国华南地区栽培的尾巨桉良种dh3213为材料，通过最关键的诱导再生的不定芽诱导培养基配方的研制和农杆菌转化程序优化入手，通过外植体材料选择、不定芽诱导培养基研制和农杆菌转化和转基因植株筛选程序的优化等，通过外源添加硝酸银和水解酪蛋白提高了不定芽诱导的效率，同时缩短了不定芽诱导的时间。同时通过遗传转化流程的优化建立了尾巨桉良种dh3213的高效、快速、稳定的遗传转化体系，为其进一步开展转基因和基因编辑育种奠定基础。

3、本发明利用栽培良种尾巨桉dh3213增殖组培芽苗暗培养后茎节间为受体，通过外源加入水解酪蛋白和硝酸银，缩短不定芽诱导周期。在根癌农杆菌介导下，将外源基因转入尾巨桉栽培良种dh3213，为进一步改良和提高尾巨桉dh3213的生长等性状提供基础，为商品化应用转基因或基因编辑尾巨桉dh3213新种质提供技术。

4、本发明的尾巨桉dh3213的遗传转化方法，包括以下步骤：

5、s1.以尾巨桉dh3213无性系无菌苗为增殖材料，在增殖培养基上培养20-25d，然后进行10d暗培养，获得白化苗；

6、s2.取白化苗茎去除顶芽和潜伏芽，切取0.5-1.0cm长的去除侧芽原基的茎段作为外植体；将茎段外植体接种到不定芽诱导培养基上预培养3d；

7、s3.将携带含gus基因和目的基因的pbi121质粒的gv3101农杆菌菌株取出，在抗性筛选平板上培养活化，挑取单菌落，转接到lb液体培养基中，培养至菌液od600值为0.4-0.7；将菌液离心后移除上清，加入重悬液将沉淀的菌体重新悬浮为od600＝0.4-0.7的菌液；

8、s4.将步骤s2中经过3d预培养的茎段外植体取出放置在步骤s3制备的重新悬浮的菌液中浸泡10min，其间不时轻微晃动使农杆菌细胞与外植体充分接触；然后将外植体转移到无菌干燥的滤纸上，吸取表面菌液；然后将外植体转移到共培养培养基上暗培养3d；

9、s5.将共培养后的茎段外植体使用200mg·l-1的头孢噻肟钠溶液清洗一次，然后使用无菌水清洗1次后转移到筛选培养基上进行筛选培养，每隔2个星期更换一下培养基，更换培养基时去除褐化、死去外植体，在更换2-3次培养基后能看到有明显的绿色的芽点；

10、s6.将带有绿色芽点的外植体转移至添加100mg·l-1cef+50mg·l-1tmt+15mg·l-1kan的增殖培养基中进行不定芽诱导和伸长培养，经过2个星期培养，部分抗性芽伸长到2-3cm且有4-6片叶时，做好标记并剪取部分叶片进行dna提取；

11、s7.取抗性芽的一个叶片，提取dna，采用nptii和gus基因特异引物进行pcr扩增；同时扩增出各目的条带的株系证明为稳定整合到尾巨桉dh3213核基因组的转基因株系；使用gus染色对检测出来的株系进行进一步确定，确保gus基因的表达，进一步验证为转基因株系；

12、s8.将鉴定出的转基因植株在添加100mg·l-1cef+50mg·l-1tmt+15mg·l-1kan的增殖培养基上进行增殖培养，待增殖到一定数量，切取长度为2-3cm生长健壮的芽苗转接至生根培养基上培养，诱导为生根苗，适时进行练苗、移栽。

13、优选，所述的增殖培养基为：改良ms培养基+0.3mg·l-1bap+0.05mg·l-1naa+30g·l-1蔗糖+6.0g·l-1卡拉胶，所述的改良ms培养基为将ms培养基中的硝酸铵的含量减少一半后得到的。

14、优选，所述的不定芽诱导培养基为：wpm+0.25mg·l-1tdz+0.1mg·l-1naa+0.1g·l-1水解酪蛋白+0.5mg·l-1agno3+30g·l-1蔗糖+6g·l-1琼脂粉，ph 5.8。

15、优选，所述的重悬液为：1/2ms+200μm as+30g·l-1蔗糖，ph5.4。

16、优选，所述的共培养培养基为：wpm+0.25mg·l-1tdz+0.1mg·l-1naa+0.1g·l-1水解酪蛋白+200μm as+30g·l-1蔗糖+6g·l-1琼脂粉，ph 5.8。

17、优选，所述的筛选培养基为添加有100mg·l-1cef+50mg·l-1tmt+15mg·l-1kan的不定芽诱导培养基，所述的不定芽诱导培养基为：wpm+0.25mg·l-1tdz+0.1mg·l-1naa+0.1g·l-1水解酪蛋白+0.5mg·l-1agno3+30g·l-1蔗糖+6g·l-1琼脂粉，ph 5.8。

18、优选，所述的生根培养基为：1/2ms培养基+0.3mg·l-1iba +20.0g.l-1蔗糖+6.0g.l-1卡拉胶+0.05g.l-1活性炭。

19、优选，所述的遗传转化方法中，培养植物材料的温度为23±2℃，除暗培养外，培养条件为：光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，时间为16h/d。

20、优选，所述的步骤s3中的抗性筛选平板为含有20mg·l-1利福平和50mg·l-1卡那霉素的lb平板。

21、本发明具有以下优点：

22、本发明提供了一种尾巨桉良种dh3213的遗传转化体系的构建方法，本发明向尾巨桉良种dh3213外植体茎段中用基因工程的手段导入目标外源基因，经过愈伤组织诱导、不定芽分化培养、增殖和生根培养，得到带有目标外源基因控制生物学性状的尾巨桉新品系。采用本发明提供的构建方法具有重复性好、成功率高的特点，转化率达到2.67％。尾巨桉良种dh3213遗传转化体系的建立为其品种的进一步改良开辟了新途径。

23、本发明提供的构建方法以茎段为起始材料构建遗传转化体系，提高了转化成功率，缩短了转化时间，可在树木生长的特定阶段分析基因功能，探究木本植物生物学的基础问题，为开展桉树功能基因的快速、高效的鉴定提供了稳定的标准的操作流程。

24、本发明提供的构建方法进一步提高了桉树不定芽的诱导效率，由于现有技术中桉树不定芽诱导效率低且周期长，采用在不定芽诱导培养基中添加0.1g·l-1水解酪蛋白和0.5mg·l-1agno3能够在30-40天成功诱导出丛生状的不定芽，不定芽诱导率超过90％且能够形成大量的丛生芽，能够进行快速的繁殖，克服了现有技术中的繁殖效率低、速度慢的技术障碍，为其他尾巨桉栽培良种提供了技术基础。

25、本发明提供的构建方法同时可以针对尾巨桉良种dh3213存在抗风和抗病性能稍弱的问题，通过转入特定目标性状改良的基因，提高其抗病和抗风性能，进一步增加其栽培面积，提高产量，同时也可转入新的性状如抗虫、抗除草剂等基因，获得新的种质，培育产量更高、质量更好以及应对生物和非生物胁迫能力更强的转基因良种，实现林木生物技术在桉树中的重大突破。

26、本发明的根癌农杆菌介导的桉树栽培良种尾巨桉dh3213的高效、快速的不定芽再生和转化方法，解决了现有桉树栽培良种包括尾巨桉dh3213尚未建立遗传转化体系以及桉树遗传转化周期长的问题。本发明突破了桉树栽培良种遗传转化体系的建立，可以直接用于桉树栽培良种dh3213转基因和基因编辑新品种创制；建立的遗传转化体系比其他体系缩短时间1/3-1/2，可以用于桉树重要性状的基因功能解析；本发明方法周期短，效率高，程序简单，操作方便，结果可靠。