水稻分蘖抑制病毒及其侵染性克隆载体和高效接种方法

本发明涉及植物病毒学和基因工程领域，特别涉及一种水稻分蘖抑制病毒及其侵染性克隆载体和水稻高效接种方法。

背景技术：

1、水稻病毒病害是水稻上最难防治的一类病害，对水稻的产量和质量等农艺性状造成了重大的影响，已报道造成危害的水稻病毒主要有十几种，这些水稻病毒病原与寄主植物长期共存处于平衡状态，其流行爆发与各自的地理分布、传播媒介、侵染周期和寄主范围等因素密切相关。水稻病毒病的流行主要通过不同种类的媒介进行传播，其中包括叶蝉、飞虱、甲虫、禾谷多黏菌等，在我国流行严重的水稻病毒病害主要是由纤细病毒属、弹状病毒科和呼肠孤病毒科的病毒所引起的，分别由不同种类的叶蝉和飞虱作为媒介昆虫以持久性增殖型的方式进行传播，不同的介体昆虫与相应的病毒会形成适应性的互作关系，采用不同的策略相互适应从而调控二者的协同进化。我国流行的这些水稻病毒主要以负链rna病毒和双链rna病毒为主，目前这些水稻病毒的反向遗传学体系还不成熟，不能成功侵染水稻。

2、水稻分蘖抑制病毒(ricetillerinhibitionvirus,rtiv)是本发明中新发现的一种致病性水稻病毒，属于梭状病毒科(solemoviridae)马铃薯卷叶病毒属(polerovirus)，该属病毒的植物寄主范围比较广泛，能够侵染十多个不同科属的植物，且病毒主要聚集在植物的韧皮部，通常会引起植物韧皮部坏死、条纹、变黄、叶片卷曲、增厚以及植株发育不良等症状。该属病毒主要由不同种类的介体蚜虫通过植物韧皮部取食获毒，以持久性非增殖型的方式传播，介体专化性强，不能通过机械接种传播，但可以通过注射病毒汁液于蚜虫体内进行传毒。polerovirus病毒的基因组大小约6000nt左右，含有一个frameshift结构和一个readthrough结构，普遍都包含有7个orfs和一个亚基因组sgrna1，个别病毒会有更多的orfs和1-2个额外的亚基因组。病毒5’末端有一个vpg蛋白，且5'末端的保守序列5’-acaa(aa)-3’和3末端茎环或类似trna的结构被认为是病毒复制过程中模板识别的关键部位。

3、以病毒侵染性克隆为基础的反向遗传学技术体系是研究植物病毒最常用的技术手段，该技术是将病毒全长基因组序列或外加病毒的特定蛋白构建到专用的侵染性克隆载体上，形成具有侵染性的活体病毒。主要构建策略包括携带花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus，camv)35s启动子驱动的植物体内转录法和利用t7、sp6、t3等原核启动子驱动的体外转录接种法。植物病毒反向遗传学体系首次建立成功的是植物单链dna病毒番茄金色花叶病毒(tomatogoldenmosaicvirus，tgmv)的侵染性克隆，植物正义链rna病毒的反向遗传学体系于1984年在雀麦花叶病毒(bromemosaicvirus，bmv)上首次建立，植物负义链rna病毒的反向遗传学体系首次于2015在苦苣菜黄网病毒(sonchusyellownet virus，synv)上构建成功，只有植物双链rna病毒的反向遗传学体系还尚未突破。我国危害严重的水稻病毒主要是负义链rna病毒和双链rna病毒，目前只有水稻条纹病毒(ricestripevirus，rsv)的侵染性克隆可以成功侵染烟草，但是还无法侵染水稻，这在很大程度上限制了水稻病毒的分子生物学研究。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种水稻分蘖抑制病毒及其侵染性克隆载体和水稻高效接种方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种水稻分蘖抑制病毒rtiv，所述水稻分蘖抑制病毒rtiv在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctcc no：v202265，保藏日期为2022年12月26日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。

4、一种水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体，其由上述的水稻分蘖抑制病毒rtiv的全长基因组序列克隆到双元植物表达载体pcass4-rz的35s启动子和核酶序列之间制备得到，所述水稻分蘖抑制病毒rtiv的全长基因组序列如seq id no.1所示。

5、上述水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体的构建包括以下步骤：

6、1)提取受水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染的野生稻总rna，用引物rtiv-r对提取的总rna进行反转录得到cdna，以反转录得到的cdna为模板，利用引物rtiv-f1和rtiv-r1扩增获得水稻分蘖抑制病毒rtiv的全长基因组序列；

7、2)采用限制性内切酶stui和bamhi酶切双元植物表达载体pcass4-rz，获得pcass4-rz线性化载体，通过无缝克隆技术将步骤1)获得的水稻分蘖抑制病毒rtiv的全长基因组序列与pcass4-rz线性化载体连接；

8、3)将步骤2)获得的连接产物转化至大肠杆菌jm109感受态细胞，提取质粒，获得水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体；

9、其中，所述引物序列如下：

10、rtiv-r：5’-ggtaccacagagcctagagagagc-3’，

11、rtiv-f1：5’-agttcatttcatttggagaggacaaaagaacgttggaggaaactcgcgt-3’，

12、rtiv-r1：5’-cggtgacagggtatcggatccggtaccacagagcctagagagagcttgtc-3’。

13、一种携带水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体的农杆菌菌株，其由上述的水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体通过冻融法导入到农杆菌gv3101获得。

14、上述的水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体，和/或上述的携带水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体的农杆菌菌株在侵染水稻中的应用。

15、上述的水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体，和/或上述的携带水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体的农杆菌菌株在制备转基因水稻中的应用。

16、上述的水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体，和/或上述的携带水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体的农杆菌菌株在水稻分蘖抑制病毒rtiv的致病性分析、病毒基因功能研究中的应用。

17、一种水稻分蘖抑制病毒rtiv的高效接种方法，包括以下步骤：

18、1)以携带水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体的农杆菌菌株转化水稻愈伤组织，经筛选获得转基因水稻；

19、2)将禾谷缢管蚜在步骤1)的转基因水稻上饲毒，再将获毒禾谷缢管蚜放置到待接种水稻植株上传毒。

20、具体的，本发明将携带水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体的农杆菌侵染中花11水稻的愈伤组织，经过分化筛选、生根筛选、炼苗筛选等步骤获得表达水稻分蘖抑制病毒的转基因水稻。阳性的转基因水稻收取种子作为稳定遗传的转基因水稻，用转基因阳性水稻苗作为毒源，将禾谷缢管蚜置于毒株上获毒3天，将蚜虫全部转移到健康的中花11水稻上进行传毒，5天后杀灭所有蚜虫。禾谷缢管蚜传毒15天后，用westernblot对水稻中的病毒外壳蛋白进行检测，水稻的阳性率可以高达80％。同时，用转基因阳性水稻苗作为毒源，尝试了禾谷缢管蚜、麦二叉蚜、麦长管蚜和无网长管蚜是否传播水稻分蘖抑制病毒，结果发现只有禾谷缢管蚜能够将该病毒传播至水稻上，并造成水稻分蘖减少的症状。表明禾谷缢管蚜是水稻分蘖抑制病毒rtiv的优势传播媒介。因此，通过防治禾谷缢管蚜可以阻断水稻分蘖抑制病毒rtiv的传播，控制禾谷缢管蚜的发生在防治该病毒病害方面具有重要应用意义。

21、本发明的显著优点在于：

22、本发明制备了水稻分蘖抑制病毒rtiv侵染性克隆载体的重组菌，该菌可以通过农杆菌介导的方式侵染水稻，用该菌制备的中花11转基因水稻可以作为水稻分蘖抑制病毒的毒源，经过禾谷缢管蚜传播也能够接回到健康水稻上。该水稻新病毒rtiv侵染性克隆的构建和高效的接种方式为研究病毒病原、水稻和媒介昆虫之间的相互作用提供了应用前景，也为防治该病毒病提供了重要资源和理论依据。