基于基因甲基化，蛋白，和/或miRNA标记的早期肝癌诊断的制作方法

本发明涉及一种基于基因甲基化标记、蛋白标记、和/或mirna标记的肝癌检测方法，以及相应的用于肝癌检测的试剂盒，可用于肝癌的筛查。相关申请的交叉引用本技术要求2022年4月22日提交的中国专利申请号202210432017.9，2022年2月11日提交的中国专利申请号202210128906.6，2022年2月11日提交的中国专利申请号202210129809.9，2022年2月10日提交的中国专利申请号202210124651.6，2022年2月25日提交的中国专利申请号202210178482.4，2022年4月22日提交的中国专利申请号202210431016.2，以及2022年4月22日提交的中国专利申请号202210438932.9的优先权，各个专利申请的内容以全文引用的方式并入本文中。

背景技术：

1、肝癌在我国是发病率和死亡率均很高的癌症之一。国家癌症中心最新统计结果显示，2016年中国肝细胞癌(简称肝癌)发病数约38.9万，在所有癌种中排列第四位；而肝癌死亡数约33.6万，居我国恶性肿瘤死亡第二位。目前在国内，肝癌筛查的主要方法仍然是血清甲胎蛋白(afp)联合超声影像检测。但afp诊断早期肝癌的灵敏度只有45.3％～62％，具有约20％的假阳性率和约40％的假阴性率，故其性能并不够理想。腹部超声(us)影像对早期肝癌的诊断灵敏度较低(32％～63％)，也容易受到仪器性能、人为操作及医师主观判断的影响。对于肝癌患者而言，早期被发现的肝癌患者，其治疗和预后效果远优于进展期肝癌患者。我国肝癌患者的五年生存率较低，只有14.1％，其中的一个主要原因是我国肝癌的早期确诊率低，超过70％的患者在确诊时已经为中期或晚期，而晚期肝癌的治疗效果和预后均较差。因此，寻找新的肝癌标志物组合，并据此建立一套准确、便捷且经济的肝癌早期诊断方法便具有重要的价值和意义。

2、近年来，基于循环肿瘤细胞(ctc)、循环肿瘤dna(ctdna)、游离rna(cfrna)以及外泌体检测的液体活检技术逐渐应用于癌症辅助诊断和早筛。而国内外也有多家企业开发了基于多种类型靶标组合的癌症早筛早诊产品及服务。美国的exact sciences开发了一套包含3-5个dna甲基化标志物与afp、afp-l3蛋白标志物的联合检测技术，用于肝癌早期诊断；该公司收购的thrive企业曾联合dna突变和蛋白检测方法，进行多种癌症的筛查；我国的泛生子则联合dna突变、dna甲基化和蛋白标志物进行肝癌检测。

3、dna异常甲基化在肿瘤发生的早期就可出现，且伴随着肿瘤发展与转移而出现异常甲基化程度增加。dna异常甲基化能引起基因表达量改变，从而通过影响细胞分裂、代谢及胞间连接来促进或抑制肿瘤发生及转移。因此，dna甲基化检测可以用于肝癌的早期诊断。微小核糖核酸(microrna，mirna)是一种单链的、长度较短的内源性非编码rna，在转录后水平调控目的基因表达。mirna广泛参与癌细胞增殖、代谢、分化侵袭及迁移，且与多种癌症发生发展及预后关系密切。另外，肝癌蛋白标志物也可被采用作为作为肝癌新标志物。综上，越来越多的研究报道发现了dna甲基化、mirna、或蛋白标志物能有效用于肿瘤的早筛早诊。而在此基础上，开发一种基于dna甲基化、mirna及蛋白标志物检测的方法和产品，将有望进一步提高肝癌早筛早诊的临床性能，并有效用于临床产业转化。

技术实现思路

1、具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题。

2、本发明的一方面，提供了一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含选自基因核酸甲基化检测试剂、蛋白检测试剂、和/或mirna检测试剂的一种或多种试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂、蛋白检测试剂、和mirna检测试剂。

3、在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自cdkl2、usp44、znf783和f12的一个，两个，三个，或全部四个基因。在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自cdkl2、usp44、和znf783的一个或多个基因。在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自cdkl2、usp44、和znf783的至少两个基因。在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含cdkl2、usp44、和znf783三个基因。

4、在一些实施例中，所述试剂盒用b2m基因作为核酸甲基化的内参，并选取不含gpg位点的b2m片段作为目的序列。

5、在一些实施例中，所述cdkl2基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与seq id no:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述cdkl2基因甲基化检测试剂包含选自seq id no:57-59的正向引物，选自seq id no:60-62的反向引物，和选自seq id no:63-65的探针。

6、在一些实施例中，所述usp44基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与seq id no:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述usp44基因甲基化检测试剂包含选自seq id no:71-73的正向引物，选自seq id no:74-76的反向引物，和选自seq id no:77-79的探针。

7、在一些实施例中，所述znf783基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与seq id no:3序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述znf783基因甲基化检测试剂包含选自seq id no:85-87的正向引物，选自seq id no:88-90的反向引物，和选自seq id no:91-93的探针。

8、在一些实施例中，所述f12基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与seq id no:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述f12基因甲基化检测试剂包含选自seq id no:100-102的正向引物，选自seq id no:103-105的反向引物，和选自seq id no:106-108的探针。

9、在一些实施例中，在对甲基化标记基因进行检测之前，将所述核酸进行亚硫酸盐转化。

10、在一些实施例中，所述核酸为血浆游离核酸。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离dna。在一些实施例中，所述试剂盒还包含针对血浆或血清的游离核酸提取试剂；优选地，所述血浆游离核酸提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。在一些实施例中，所述试剂盒的每个基因核酸甲基化的检测试剂包含至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。

11、在一些实施例中，所述试剂盒包含蛋白检测试剂，所述蛋白包含选自甲胎蛋白(afp)、异常凝血酶原(dcp)、单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)和生长分化因子-15(gdf-15)的一个、两个，三个，或全部四个蛋白。在一些实施例中，所述蛋白包含afp蛋白或dcp蛋白。在一些实施例中，所述蛋白包含afp和dcp两个蛋白。在一些实施例中，所述蛋白检测试剂是用于选自elisa、化学发光、免疫荧光、和流式芯片的一种或多种检测的检测试剂。在一些实施例中，所述蛋白为血浆或血清样本的蛋白。在一些实施例中，所述试剂盒包含针对血浆或血清样本的蛋白提取试剂。

12、在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测mirna的检测试剂，所述mirna包含选自hsa-mir-33b-3p，hsa-mir-92b-3p，hsa-mir-205-5p，hsa-mir-374c-5p，hsa-mir-4516-3p，和hsa-mir-6803-3p的一个、两个，三个，四个，五个，或全部六个mirna。在一些实施例中，所述mirna包含选自hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p、和hsa-mir-6803-3p的一个或多个mirna。在一些实施例中，所述mirna包含选自hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p、和hsa-mir-6803-3p的至少两个mirna。在一些实施例中，所述mirna包含hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p、和hsa-mir-6803-3p三个mirna。在一些实施例中，所述试剂盒还包含检测内参mirna的检测试剂，所述内参mirna是hsa-mir-16-5p。在一些实施例中，所述试剂盒还包含检测外参mirna的检测试剂，所述外参mirna是cel-mir-39-5p。在一些实施例中，所述mirna检测试剂包含至少一个逆转录引物，至少一个扩增引物，和/或至少一个探针。

13、在一些实施例中，(i)所述检测hsa-mir-33b-3p的检测试剂包含seq id no:115所示的逆转录引物、seq id no:116和seq id no:117所示的扩增引物，和/或seq id no:118所示的探针；(ii)所述检测hsa-mir-92b-3p的检测试剂包含seq id no:119所示的逆转录引物、seq id no:120和seq id no:121所示的扩增引物，和/或seq id no:122所示的探针；(iii)所述检测hsa-mir-205-5p的检测试剂包含seq id no:123所示的逆转录引物、seq idno:124和seq id no:125所示的扩增引物，和/或seq id no:126所示的探针；(iv)所述检测hsa-mir-374c-5p的检测试剂包含seq id no:127所示的逆转录引物、seq id no:128和seqid no:129所示的扩增引物，和/或seq id no:130所示的探针；(v)所述检测hsa-mir-4516-3p的检测试剂包含seq id no:131所示的逆转录引物、seq id no:132和seq id no:133所示的扩增引物，和/或seq id no:134所示的探针；和/或(vi)所述检测hsa-mir-6803-3p的检测试剂包含seq id no:135所示的逆转录引物、seq id no:136和seq id no:137所示的扩增引物，和/或seq id no:138所示的探针。

14、在一些实施例中，所述mirna为血浆或血清样本的mirna。在一些实施例中，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的mirna提取试剂。

15、在一些实施例中，所述试剂盒包含针对表13中任一标志物组合的检测试剂。

16、在一些实施例中，所述试剂盒包含:(a)针对cdkl2、usp44和znf783基因核酸甲基化的检测试剂；(b)针对hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p和hsa-mir-6803-3p的检测试剂；以及(c)针对afp和dcp蛋白的检测试剂。

17、在一些实施例中，所述试剂盒包含:(a)针对cdkl2、usp44和znf783基因核酸甲基化的检测试剂；(b)针对hsa-mir-92b-3p和hsa-mir-6803-3p的检测试剂；以及(c)针对afp和dcp蛋白的检测试剂。

18、在一些实施例中，所述试剂盒包含:(a)针对cdkl2、usp44、znf783和f12基因核酸甲基化的检测试剂；(b)针对hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p和hsa-mir-6803-3p的检测试剂；以及(c)针对afp和dcp蛋白的检测试剂。

19、在一些实施例中，所述肝癌包括早期肝癌。在一些实施例中，所述试剂盒是针对血浆或血清样本。在一些实施例中，所述试剂盒还包含针对血浆或血清样本处理的试剂。

20、本发明的一方面，提供了本发明所述的试剂盒在制备肝癌检测的产品的应用。

21、本发明的一方面，提供了一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含以下三类标记检测的一种或多种：(i)基因核酸甲基化检测；(ii)蛋白检测；和/或(iii)mirna检测。

22、本发明的一方面，提供了一种生物标记物检测产品在制备肝癌检测的产品的用途，其特征在于，所述产品包含以下三类标记检测的一种或多种：(i)基因核酸甲基化检测；(ii)蛋白检测；和/或(iii)mirna检测。

23、在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含以下三类标记检测：(i)基因核酸甲基化检测；(ii)蛋白检测；和(iii)mirna检测。

24、在一些实施例中，所述基因包含选自cdkl2、usp44、znf783和f12的一个，两个，三个，或全部四个基因。在一些实施例中，所述基因包含选自cdkl2、usp44、和znf783的一个或多个基因。在一些实施例中，所述基因包含选自cdkl2、usp44、和znf783的至少两个基因。在一些实施例中，所述基因包含cdkl2、usp44、和znf783三个基因。在一些实施例中，所述产品/方法/用途用b2m基因作为核酸甲基化的内参，并选取不含gpg位点的b2m片段作为目的序列。

25、在一些实施例中，所述cdkl2基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与seqid no:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述cdkl2基因甲基化检测的试剂包含选自seq id no:57-59的正向引物，选自seq id no:60-62的反向引物，和选自seq id no:63-65的探针。

26、在一些实施例中，所述usp44基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与seqid no:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述usp44基因甲基化检测的试剂包含选自seq id no:71-73的正向引物，选自seq id no:74-76的反向引物，和选自seq id no:77-79的探针。

27、在一些实施例中，所述znf783基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与seq id no:3序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述znf783基因甲基化检测的试剂包含选自seq id no:85-87的正向引物，选自seq id no:88-90的反向引物，和选自seq id no:91-93的探针。

28、在一些实施例中，所述f12基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与seqid no:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述f12基因甲基化检测的试剂包含选自seq id no:100-102的正向引物，选自seq id no:103-105的反向引物，和选自seq id no:106-108的探针。

29、在一些实施例中，所述产品/方法/用途在对甲基化标记基因进行检测之前，将所述核酸进行亚硫酸盐转化。在一些实施例中，所述核酸为血浆游离核酸。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离dna。

30、在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包含针对血浆或血清的游离核酸提取步骤。在一些实施例中，所述血浆游离核酸提取步骤通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。

31、在一些实施例中，所述产品/方法/用途的每个基因核酸甲基化的检测使用至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。

32、在一些实施例中，所述产品/方法/用途的所述蛋白包含选自afp、dcp、mcp-1、和/或gdf-15的一个、两个，三个，或全部四个蛋白。在一些实施例中，所述蛋白包含afp蛋白或dcp蛋白。在一些实施例中，所述蛋白包含afp和dcp两个蛋白。

33、在一些实施例中，所述产品/方法/用途的蛋白检测是用于选自elisa、化学发光、免疫荧光、和流式芯片的一种或多种检测方法。在一些实施例中，所述蛋白为血浆或血清样本的蛋白。在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含针对血浆或血清样本的蛋白提取步骤。

34、在一些实施例中，所述产品/方法/用途的所述mirna包含选自hsa-mir-33b-3p，hsa-mir-92b-3p，hsa-mir-205-5p，hsa-mir-374c-5p，hsa-mir-4516-3p，和hsa-mir-6803-3p的一个、两个，三个，四个，五个，或全部六个mirna。在一些实施例中，所述mirna包含选自hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p、和hsa-mir-6803-3p的一个或多个mirna。在一些实施例中，所述mirna包含选自hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p、和hsa-mir-6803-3p的至少两个mirna。在一些实施例中，所述mirna包含hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p、和hsa-mir-6803-3p三个mirna。在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包含检测内参mirna的检测，所述内参mirna是hsa-mir-16-5p。在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包含检测外参mirna的检测，所述外参mirna是cel-mir-39-5p。

35、在一些实施例中，所述产品/方法/用途的所述mirna检测使用至少一个逆转录引物，至少一个扩增引物，和/或至少一个探针。在一些实施例中，(i)所述检测hsa-mir-33b-3p的检测试剂包含seq id no:115所示的逆转录引物、seq id no:116和seq id no:117所示的扩增引物，和/或seq id no:118所示的探针；(ii)所述检测hsa-mir-92b-3p的检测试剂包含seq id no:119所示的逆转录引物、seq id no:120和seq id no:121所示的扩增引物，和/或seq id no:122所示的探针；(iii)所述检测hsa-mir-205-5p的检测试剂包含seqid no:123所示的逆转录引物、seq id no:124和seq id no:125所示的扩增引物，和/或seqid no:126所示的探针；(iv)所述检测hsa-mir-374c-5p的检测试剂包含seq id no:127所示的逆转录引物、seq id no:128和seq id no:129所示的扩增引物，和/或seq id no:130所示的探针；(v)所述检测hsa-mir-4516-3p的检测试剂包含seq id no:131所示的逆转录引物、seq id no:132和seq id no:133所示的扩增引物，和/或seq id no:134所示的探针；和/或(vi)所述检测hsa-mir-6803-3p的检测试剂包含seq id no:135所示的逆转录引物、seq id no:136和seq id no:137所示的扩增引物，和/或seq id no:138所示的探针。

36、在一些实施例中，所述产品/方法/用途的所述mirna为血浆或血清样本的mirna。

37、在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包括针对血浆或血清样本的mirna提取的步骤。

38、在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含针对表13中任一标志物组合的检测。

39、在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含:(a)针对cdkl2、usp44和znf783基因核酸甲基化的检测；(b)针对hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p和hsa-mir-6803-3p的检测；以及(c)针对afp和dcp蛋白的检测。

40、在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含:(a)针对cdkl2、usp44和znf783基因核酸甲基化的检测；(b)针对hsa-mir-92b-3p和hsa-mir-6803-3p的检测；以及(c)针对afp和dcp蛋白的检测。

41、在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含:(a)针对cdkl2、usp44、znf783和f12基因核酸甲基化的检测；(b)针对hsa-mir-92b-3p、hsa-mir-374c-5p和hsa-mir-6803-3p的检测；以及(c)针对afp和dcp蛋白的检测。

42、在一些实施例中，所述产品/方法/用途检测的肝癌包括早期肝癌。

43、在一些实施例中，所述产品/方法/用途是针对血浆或血清样本。

44、在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包含针对血浆或血清样本的处理步骤。