一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、延缓皮肤衰老是一个永恒的研究课题，近几年来我国抗衰市场容量持续高速增长。根据福布斯和euromonitor的调查数据显示，2018年中国抗衰市场规模已达到472亿元，同比增速高达17.0％；2019年规模达到575亿元，同比增长21.8％，约占整体化妆品市场规模的12％；且从2016年起，呈现持续加速趋势，近五年复合增速达11.8％，具有非常好的前景。根据中国香精香料化妆品工业协会发布的数据，目前女性最关心、最热门的保养服务项目就是抗衰老保养，其在所有项目中的提及率高达72.2％，有90％的中国女性都采取过抗衰措施。预测到2021年，全球抗衰市场规模将达到2160亿美元。目前市场上普通延衰化妆品的活性成分主要有多肽、植物活性多酚等，延衰的产品主要面临着产品组合单一、市场定位重复、同质化现象严重等问题。

2、有研究者发现，酵母具有很强的应激反应能力，当它受到应激胁迫，比如紫外照射，热刺激或化学损伤等氧化胁迫时，酵母会在适应过程中，诱导进化出一套完整的感应机制，自动迅速合成许多具有自我修复性的保护性物质，以抵御这些氧化损伤所引起的伤害作用。

3、外泌体是由细胞释放出来的生物分子纳米结构，它们携带特定的生物分子信息，自30多年前被发现以来，因为其独特生物学特性及功能研究热度不衰，最新研究表明，干细胞的外泌体在机体抗衰老过程中发挥非常重要的作用。目前已知干细胞外泌体有抗衰与美肤功效的核心因子具有上百种，例如细胞因子fgf、egf，细胞信号蛋白wnt4、wnt11，抗衰老mirna：mirna-124a，mirna125b，mirna21，mirna-146a，mirna-181c，mirna-let-7b等。但同时干细胞产业化及应用存在一定的限制。酵母是一类单细胞真核模式生物，蛋白质含量为40％-60％，其蛋白质水解产物包括人体必需的八种氨基酸，研究酵母外泌体的制备方法及功效，对促进酵母在药品、食品、化妆品等领域中的应用，具有重大意义。

4、cn110777083a公开了一种从酵母细胞中提取获得的外泌体，所述外泌体内部含有特异肽段蛋白。提供了一种从酵母细胞中提取外泌体的方法，包括以下步骤：对酵母细胞进行培养，获得细胞培养物后进行离心，收集上清过滤后，将上清与分离液混合，再次离心，获得的沉淀物即为酵母细胞外泌体。该方法的外泌体是从酵母细胞中提取获得，它含有特异肽段蛋白，基于该特点可将其作为酵母的标志物，运用于临床，具有极大的市场前景和应用价值。

5、cn114009754a公开了一种发酵植物外泌体的制备方法，通过酶解、混料、灭酶提取、发酵培养、离心等工艺制备得到新型的食品原料发酵植物外泌体。与传统植物外泌体的制备方法不同，发酵植物外泌体主要通过酶解和发酵两个重要环节实现，通过酶制剂在特定温度和时间下的酶解作用，发挥最佳酶解效果，通过发酵菌粉在特定温度和时间下的发酵作用达到一定的酸度，得到发酵植物外泌体。

6、现有技术公开了一系列外泌体的制备方法，但是由于外泌体生物活性高而无法长期保存，因此，开发一种高生物活性、可以长期保存并且具备良好的护肤功效的外泌体是本领域的研究重点。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用，可以长期保持高生物活性，并且可以用于缓解皮肤炎症、防止氧化。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种酵母来源外泌体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

4、(1)将酵母培养至对数期时，进行仿真环境亚刺激处理，同时加入氨基酸，之后继续培养至稳定期，得到发酵液；

5、(2)将所述发酵液进行固液分离得到细胞外泌体；将所述细胞外泌体与糖类混合，得到所述酵母来源外泌体。

6、本发明采用仿真环境亚刺激对处于对数期的酵母进行刺激，酵母细胞产生应激反应，分泌高活性外泌体，同时加入氨基酸，可以与其他物质复合更有效发挥抗氧化作用；将发酵液进行固液分离，有效去除固体杂质，可以获取纯度更高的外泌体；将提取的外泌体与糖类混合，是由于外泌体生物活性较高，不易保存，当和糖类进行混合后，在不降低生物活性的同时可以有效提升保存时间。

7、优选地，所述酵母的接种量为6-10％，例如可以为7％、8％或9％等。

8、优选地，所述酵母包括啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母或假丝酵母中的任意一种或至少两种的组合。

9、优选地，所述酵母为啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的组合。

10、优选地，所述假丝酵母为柬埔寨藤黄(garcinia cambogia)。

11、优选地，所述啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的接种比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)，例如可以为1:0.8:0.9、1:0.9:0.9、1:0.8:1、1:1:0.9、1:1:1、1:1.1:1.2或1:1.2:1.1等。

12、优选地，所述培养至对数期的时间为8-15h，例如可以为9h、10h、12h、13h或14h等。

13、优选地，所述继续培养至稳定期的时间为30-45h，例如可以为32h、35h、38h或42h等。

14、优选地，步骤(1)中所述培养至对数期和继续培养至稳定期的温度各自独立地为25-30℃，例如可以为26℃、27℃、28℃或29℃等。

15、上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

16、优选地，所述仿真环境亚刺激包括氧化应激刺激、高渗透压刺激、高温刺激或低温刺激中的任意一种。

17、优选地，所述氧化应激刺激采用的试剂为双氧水。

18、优选地，所述氧化应激刺激时培养基中h2o2的含量为0.08-0.25mmol/l，例如可以为0.1mmol/l、0.13mmol/l、0.16mmol/l、0.2mmol/l、0.24mmol/l等，优选为0.2mmol/l。

19、优选地，所述高渗透压刺激采用的试剂为盐水溶液。

20、优选地，所述盐水溶液包括氯化钾水溶液和/或氯化钠水溶液。

21、优选地，所述高渗透压刺激时培养基中盐的浓度为0.3-0.8mmol/l，例如可以为0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l或0.7mmol/l等，优选为0.5mmol/l。

22、优选地，所述高温刺激的温度为37-40℃，例如可以为38℃、39℃或39.5℃等。

23、优选地，所述低温刺激的温度为0-15℃，例如可以为1℃、4℃、8℃或12℃等。

24、优选地，所述氨基酸包括半胱氨酸、甲硫氨酸或胱氨酸中的一种或至少两种的组合，优选为半胱氨酸。

25、优选地，所述氨基酸的添加量占培养基的质量百分比为0.1-0.25％，例如可以为0.15％、0.2％或0.24％等。

26、优选地，所述固液分离包括离心、一次过滤、浓缩、二次过滤的步骤。

27、优选地，所述离心的时间为8-12min，例如可以为9min、10min或11min等；转速为3000-6000rpm，例如可以为4000rpm、4500rpm或5000rpm等。

28、优选地，所述一次过滤的滤膜孔径为80-100kda，例如可以为85kda、90kda或95kda等。

29、优选地，所述二次过滤的滤膜孔径为20-30kda，例如可以为23kda、26kda或29kda等。

30、优选地，所述浓缩至体积缩小至1/6-1/4，例如可以为1/6、1/5或1/4等。

31、上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

32、本发明固液分离采用离心和两次过滤进行，离心的目的是除去发酵液中的培养基杂质和细胞碎片，第一次过滤后收集上清液，有效除去小分子，第二次过滤是在浓缩之后进行，采用孔径较小的滤膜进行过滤，有效分离出溶液，留用沉淀即为细胞外泌体。

33、优选地，所述糖类为海藻多糖溶液。

34、优选地，所述海藻多糖溶液中海藻多糖的质量百分含量为1-4％，例如可以为2％、2.5％或3％等。

35、优选地，所述混合时海藻多糖溶液与细胞外泌体的质量比为1:(0.8-1.2)，例如可以为1:0.9、1:1或1:1.1等。

36、优选地，所述混合后还包括冷冻干燥的步骤。

37、优选地，所述制备方法包括如下步骤：

38、(1)在25-30℃条件下将酵母培养8-15h，至对数期时，进行仿真环境亚刺激处理，同时加入氨基酸，继续培养30-45h，至稳定期时，得到发酵液；

39、所述酵母的接种量为6-10％，所述酵母为啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的组合，所述啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的接种比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)；

40、所述仿真环境亚刺激包括氧化应激刺激、高渗透压刺激、高温刺激或低温刺激中的任意一种，所述氧化应激刺激采用的试剂为双氧水，所述氧化应激刺激时培养基中h2o2的含量为0.08-0.25mmol/l；所述高渗透压刺激采用的试剂为盐水溶液，所述盐水溶液包括氯化钾水溶液和/或氯化钠水溶液，所述高渗透压刺激时培养基中盐的浓度为0.3-0.8mmol/l；所述高温刺激的温度为37-40℃；所述低温刺激的温度为0-15℃；

41、所述氨基酸包括半胱氨酸、甲硫氨酸或胱氨酸中的一种或至少两种的组合，所述氨基酸的添加量占培养基的质量百分比为0.1-0.25％；

42、(2)将所述发酵液进行8-12min，转速为3000-6000rpm的离心、采用孔径为80-100kda的滤膜进行一次过滤、浓缩、采用孔径为20-30kda的滤膜进行二次过滤得到细胞外泌体；将所述细胞外泌体与海藻多糖溶液混合后，进行冷冻干燥，得到所述酵母来源外泌体；

43、所述海藻多糖溶液中海藻多糖的质量百分含量为1-4％，所述混合时海藻多糖溶液与细胞外泌体的质量比为1:(0.8-1.2)。

44、上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

45、第二方面，本发明提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体通过第一方面提供的制备方法制备得到。

46、第三方面，本发明提供一种如第二方面提供的酵母来源外泌体在保健品、药品或化妆品中的应用。

47、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

48、本发明采用仿真环境亚刺激对酵母细胞进行刺激，酵母细胞产生应激反应，分泌高活性外泌体，同时加入氨基酸，可以与其他物质复合更有效发挥抗氧化作用；将提取的外泌体与糖类混合，在不降低生物活性的同时可以有效提升保存时间；本发明制备的酵母来源外泌体具备良好的抗炎症和抗氧化功效，同时可促进i和iii型胶原蛋白再生。