一种催化小分子含氮杂环化合物氮乙酰化的方法

本发明属于酶工程研究开发，具体涉及一种催化小分子含氮杂环化合物氮乙酰化的方法。

背景技术：

1、酰胺基团作为化学结构单元中重要的功能性基团，存在于许多药物分子中，如酪氨酸激酶抑制剂imiatinib、抗hiv药物dolutegravir、治疗囊性纤维化药物ivacaftor、治疗多发性硬化药物terflunamide、抗生素药物β-内酰胺等。在过去40年药物合成中，酰胺键的合成占所有化学反应的21.3％，2011年对三大国际制药公司研发的药物进行抽样统计发现，54％的药物结构存在酰胺键，这些数据进一步说明了酰胺键结构的重要性。目前，传统化学法合成酰胺一般分为两步或多步反应，该过程需要偶联试剂对羧酸活化，形成酰氯、酸酐、酰基叠氮化物等活性中间体，活性中间体进一步与胺进行亲核取代从而形成酰胺。但这种方法转化率很低，且要用到许多腐蚀性和毒性很大的试剂，导致原子经济性差。如制备1kg的抗艾滋病药物fuzeon(36个氨基酸)，即使不包括合成和纯化步骤所需的有机试剂，仍需要45kg原材料。2007年，美国化学会绿色化学研究所投票决定将“高效、经济地合成酰胺”作为合成化学中的顶级挑战领域之一。

2、目前，生物催化已成功地用于许多关键的转化，如：还原、羟化、氧化、水解等，有些领域已实现工业化。属于α/β水解酶的角质酶，具有角质酶特征性的甘氨酸(gly)-酪氨酸(tyr)-丝氨酸(ser)-谷氨酰胺(gln)-甘氨酸(gly)氨基酸序列以及丝氨酸(ser)-组氨酸(his)-天冬氨酸(asp)催化三联体。根据来源角质酶可分为原核角质酶或真核角质酶，真核角质酶的最适温度一般在30-40℃之间；原核角质酶具有较高的最适温度，一般在50-60℃之间。同属于α/β水解酶的脂肪酶，其特征为具有由一个或多个α螺旋组成的“盖子”，该盖子具有亲水亲油性的性质，使得脂肪酶具有界面活化作用。相对于脂肪酶，绝大多数角质酶没有脂肪酶结构中的“盖子”，因此角质酶的催化关键氨基酸丝氨酸暴露于溶剂；另外，角质酶催化三联体一般位于由疏水氨基酸包围的表面沟槽中，有利于容纳底物。这就为角质酶带来了较广的底物范围，如聚酯的聚合及降解，同时这一特性也为含氮杂环的氮乙酰生物催化提供了更多可能。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中暂无催化含氮杂环氮乙酰化反应的问题，提供了一种酶工具，具体技术方案如下：

2、本发明提供了一种催化小分子含氮杂环化合物氮乙酰化的方法，所述方法包括以下步骤：

3、步骤1：将角质酶基因修饰的质粒导入大肠杆菌bl-21，获得重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行培养，当菌液od600于0.6至0.8之间时，进行诱导，诱导后将发酵液离心，弃去上清液，菌体使用pbs缓冲液重悬，并重复离心步骤两次，得到大肠杆菌bl21悬浮液；

4、步骤2：使用高压细胞破碎仪将菌体破碎，离心，舍弃沉淀，得到粗酶液；配置纯化蛋白所需溶剂，使用镍柱进行蛋白纯化，得到目的蛋白，使用超滤管进行浓缩，得到纯化酶；

5、步骤3：将氨基供体、酰基供体溶于有机溶剂中，加入纯化酶反应，进行气相定量检测。

6、在本发明的一种实施方式中，步骤1中所述角质酶为如下角质酶中的任意一种：

7、氨基酸序列如seq id no.1所示的cutinase1；

8、氨基酸序列如seq id no.2所示的cutinase2；

9、氨基酸序列如seq id no.3所示的cutinase3；

10、氨基酸序列如seq id no.4所示的cutinase4；

11、氨基酸序列如seq id no.5所示的cutinase5；

12、氨基酸序列如seq id no.6所示的cutinase6。

13、本发明的一种实施方式中，步骤1所述培养为使用lb-kana液体培养基于37℃条件下培养；诱导条件为：加入终浓度0.5mm的iptg，于16℃温度下诱导16h；所述离心条件为：4℃、8000rpm条件下离心5min。

14、在本发明的一种实施方式中，步骤2所述离心条件为4℃、13500rpm条件下离心30min。

15、在本发明的一种实施方式中，步骤2所述配置纯化蛋白所需溶剂的配置方法如下：准确称量8.95gna2hpo4·12h2o、8.766gnacl、0.3404g咪唑于500mlup水中得到bindingbuffer；准确称量8.95gna2hpo4·12h2o、8.766gnacl、1.5318g咪唑于500mlup水中得到washingbuffer；准确称量8.95gna2hpo4·12h2o、8.766gnacl、17.02g咪唑于500mlup水中得到elutionbuffer。

16、在本发明的一种实施方式中，步骤2所述蛋白纯化步骤为：先使用5个柱体积的bindingbuffer平衡柱子，粗酶液反复上样三次，使用5个柱体积的washingbuffer冲洗杂蛋白，使用3个柱体积的elutionbuffer收集目标蛋白。

17、在本发明的一种实施方式中，步骤3中所述氨基供体包括但不限于哌啶、吗啉、四氢吡咯、哌嗪、n-甲基哌嗪。

18、在本发明的一种实施方式中，步骤3中所述氨基供体还包括羟基、羰基、酯基、卤素、烷基、芳基等任意一种取代基修饰的哌啶、吗啉、四氢吡咯、哌嗪、n-甲基哌嗪衍生物。

19、在本发明的一种实施方式中，步骤3中所述酰基供体为羧基修饰化合物，包括但不限于乙酸、丙酸、丁酸；所述氨基供体与酰基供体的物质的量之比为1：1.1～5。

20、在本发明的一种实施方式中，步骤3中所述有机溶剂为乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、正己烷、水中的任意一种或两种以上的混合物。

21、在本发明的一种实施方式中，步骤3中所述纯化酶的终浓度为0.1～5mg/ml；所述反应温度为15～60℃，反应时间为0.5～72h。

22、在本发明的一种实施方式中，步骤3所述气相检测条件为：气相色谱采用agilent8890gc系统，气相检测条件为：30m×250μm×250μmhp-innowax色谱柱，加热器220℃，空气流量400ml/min，氢气燃气流量30ml/min，尾气(n2)流量25ml/min。柱温箱温度最高270℃，柱温箱温度梯度设置为：初始温度80℃，15℃/min升温至200℃后保持5min，20℃/min升温至240℃，保持5min。

23、本发明的有益效果：

24、本发明针对现有技术暂无酶催化含氮杂环氮乙酰化反应的问题，提供了利用一类角质酶高效催化氮杂环乙酰化反应的方法，具有如下优势：

25、(1)本发明选取便宜的羧酸类化合物为原料，首次以角质酶为催化剂制备乙酰基修饰的氮杂环衍生物，是一条绿色安全的制备方法。

26、(2)本发明用到的角质酶是具有α-β丝氨酸水解酶特征的丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸催化三联体，能够高效催化脱水反应；同时无脂肪酶类α-β丝氨酸水解酶特征的“盖子结构”，可有效结合亲水性的氮杂环、乙酸，有利于分子结构较大的氮杂环底物与活性中心的识别。