一种重组Mh-DnaK蛋白及其在检测猪源嗜血支原体中的应用

本发明涉及生物。更具体地，涉及一种重组mh-dnak蛋白及其在检测猪源嗜血支原体中的应用。

背景技术：

1、嗜血支原体(hemotropic mycoplasma，hm又称附红细胞体)是一类寄生于多种哺乳动物红细胞表面及骨髓中的支原体，属于柔膜菌纲(mollicutes)支原体属(mycoplasma)(陆承平，主编.兽医微生物学[m].第六版.北京：中国农业出版社2021：223-225)。hm破坏宿主红细胞引起溶血和传染性贫血，导致母猪流产死胎，仔猪和育肥猪发烧、贫血引起的皮肤苍白、黏膜黄染以及消瘦(hoelzle l e,felder k m,hoelzle k.porcineeperythrozoonosis:from eperythrozoon suis to mycoplasma suis[j].tierarztlprax ausg g grosstiere nutztiere.2011,39(4):215-220.)。中国猪群中流行三种hm，猪支原体(mycoplasma suis，m.suis旧称猪附红细胞体)、微小支原体(m.parvum)和2017年中国报道的猪嗜血支原体(mycoplasma haemosuis，m.haemosuis)(张浩吉，谢明权，张健騑，等.猪附红细胞体16s rrna基因的序列测定和系统进化分析[j].畜牧兽医学报.2005(06):596-601.；watanabe y,fujihara m,obara h,et al.two genetic clusters in swinehemoplasmas revealed by analyses of the 16srrna and rnase p rna genes[j].jvet med sci.2011,73(12):1657-1661.；fu y,shi t y,xu l h,et al.identificationof a novel hemoplasma species from pigs in zhejiang province,china[j].j vetmed sci.2017,79(5):864-870)，2022年泰国报道了第四种感染猪的嗜血支原体，目前中国尚未有报道(thongmeesee k,kamkong p,thanee s,wattanapansak s,kaewthamasorn m,tiawsirisup s.molecular detection and genetic analysis of porcinehaemoplasmas in commercial pig farms from thailand reveal a putative novelspecies.transbound emerg dis.2022mar 26.doi:10.1111/tbed.14537.pubmed pmid:35338759.)。

2、通过荧光定量pcr方法流行病学调查发现，m.haemosuis在中国浙江、江苏、河南等地流行，与其他两种猪源hm混合感染多有发生，母猪感染率较高(fu y,shi t y,xu l h,etal.identification of a novel hemoplasma species from pigs in zhejiangprovince,china[j].j vet med sci.2017,79(5):864-870.；付媛，石团员，袁秀芳等.猪源嗜血支原体三重taqman探针荧光定量pcr方法建立和应用.农业生物技术学报，2022.30(6))，韩国、德国和泰国也在猪群中检测到m.haemosuis(thongmeesee k,kamkong p,thanee s,wattanapansak s,kaewthamasorn m,tiawsirisup s.molecular detectionand genetic analysis of porcine haemoplasmas in commercial pig farms fromthailand reveal a putative novel species.transbound emerg dis.2022mar 26.doi:10.1111/tbed.14537.pubmed pmid:35338759.；seo m g,kwon o d,kwakd.2019.prevalence and phylogenetic analysis of hemoplasma species in domesticpigs in korea.parasites vectors,12(1):378.；stadler j,ade j,ritzmann m,etal.2020.detection of a novel haemoplasma species in fattening pigs with skinalterations,fever and anaemia.vet record,187(2):66.)，已有m.suis和m.parvum血清抗体检测方法的报道(amit kadam，王金秀，谢高槿，等.血清学和分子生物学流行病学调查揭示了微小支原体/附红细胞体是海南岛主要猪嗜血支原体[j].寄生虫与医学昆虫学报.2018,25(03):140-147.；hsu f s,liu m c,chou s m,et al.evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of eperythrozoon suis antibodies inswine[j].am j vet res.1992,53(3):352-354.；hoelzle l e,hoelzle k,helbling m,etal.msg1,a surface-localised protein of mycoplasma suis is involved in theadhesion to erythrocytes[j].microbes infect.2007,9(4):466-474.)，缺少m.haemosuis的抗体检测方法。

3、分子伴侣蛋白在协助新合成的多肽折叠、组装和运输过程中发挥着重要的作用，dnak在大肠杆菌中是伴侣蛋白网络的中心枢纽(calloni g,chen t,schermann sm,changhc,genevaux p,agostini f,tartaglia gg,hayer-hartl m,hartl fu.dnak functionsas a central hub in the e.coli chaperone network.cell rep.2012mar 29；1(3):251-64.pii:s2211-1247(11)00017-9.doi:10.1016/j.celrep.2011.12.007.pubmedpmid:22832197.)，也是支原体的重要分子伴侣蛋白，属于热激蛋白70(hsp70)家族，支原体的dnak在识别dna损伤和修复的途径中起关键作用，该蛋白与多聚体聚合酶(parp)-1结合，降低其催化活性，同时也影响宿主细胞的p53基因的稳定性和抗肿瘤功能(benedetti f,cocchi f,latinovic os,curreli s,krishnan s,munawwar a,gallo rc,zella d.roleof mycoplasma chaperone dnak in cellular transformation.int j mol sci.2020feb15；21(4)pii:ijms21041311.doi:10.3390/ijms21041311.pubmed pmid:32075244.)。目前，m.haemosuis的dnak蛋白原核表达的研究未见报道。

4、因此，克隆到猪嗜血支原体m.haemosuis的dnak蛋白的基因序列，并以此蛋白为基础的构建猪源嗜血支原体抗体间接elisa检测方法对猪源嗜血支原体的临床诊断、流行病学研究和免疫检测具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种猪嗜血支原体m.haemosuis重组dnak蛋白(简称为重组mh-dnak蛋白)，用于检测猪源嗜血支原体抗体水平和流行病学监测，评估该病在猪源嗜血支原体病流行中承担的角色。

2、本发明的第二个目的在于提供上述重组mh-dnak蛋白在检测猪源嗜血支原体中的应用和/或在检测猪源嗜血支原体抗体中的应用。

3、本发明的第三个目的在于提供一种猪源嗜血支原体抗体间接elisa检测试剂盒。

4、本发明的第四个目的在于提供一种猪源嗜血支原体抗体间接elisa检测方法。

5、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

6、第一方面，本发明提供了一种猪嗜血支原体m.haemosuis重组dnak蛋白，简称为重组mh-dnak蛋白，所述重组mh-dnak蛋白的氨基酸序列如seq idno.1所示。

7、本发明所述重组mh-dnak蛋白是由如下方法制备而成：

8、以seq id no.2第4-1812位所示的优化后的mh-dnak基因构建重组质粒，通过表达系统表达得到所述重组mh-dnak蛋白；其中，所述优化后的mh-dnak基因对如seq id no.3所示的mh-dnak基因(编码氨基酸序列如seq id no.1第21-622位所示的mh-dnak蛋白)进行密码子优化，将3个tga优化为能在大肠杆菌中编码色氨酸的密码子tgg和部分密码子优化为大肠杆菌偏好密码子得到的。

9、在本发明具体的实施方式中，所述重组质粒为pet28-mh-dnak。所述pet28-mh-dnak是将pet-28a(+)质粒的ndei酶和xhoi酶识别序列间的dna片段替换为序列表中seq idno.2第4-1812位所示的优化后的mh-dnak基因得到的重组质粒，该重组质粒能表达序列表中seq id no.1所示的重组mh-dnak蛋白；其中，序列表中seq id no.1第1-20位为pet-28a(+)质粒上dna序列所编码氨基酸序列，seq id no.1第21-622位为mh-dnak蛋白序列。

10、进一步，所述表达系统为大肠杆菌表达系统。

11、在本发明具体的实施方式中，所述表达是将pet28-mh-dnak转化入大肠杆菌bl21(de3)中诱导表达得到重组mh-dnak蛋白。

12、第二方面，本发明提供了上述重组mh-dnak蛋白在如下任一种的应用：

13、1)检测待测动物的血清是否含有猪源嗜血支原体抗体中的应用；

14、2)在制备检测待测动物的血清是否含有猪源嗜血支原体抗体产品中的应用；

15、3)检测待测动物是否感染或感染过猪源嗜血支原体中的应用；

16、4)在制备检测待测动物是否感染或感染过猪源嗜血支原体产品中的应用。

17、进一步，所述猪源嗜血支原体为mycoplasma suis、mycoplasma parvum和/或mycoplasma haemosuis。

18、第三方面，本发明提供了一种猪源嗜血支原体抗体间接elisa检测试剂盒，所述试剂盒包括以上述重组mh-dnak蛋白作为包被抗原的酶标板。

19、进一步，所述重组mh-dnak蛋白的包被浓度为0.44μg/ml。

20、进一步，所述试剂盒还包括包被液、封闭液、洗涤液、m.haemosuis阳性血清、m.haemosuis阴性血清、酶标二抗、底物显色液和终止液中一种或多种。

21、进一步，所述包被液为ph9.6 0.01m的碳酸盐缓冲液(1.59g na2co3和2.93gnahco3加去离子水至1000ml得到)。

22、进一步，所述封闭液为2.5％脱脂奶粉(100mlpbst加入2.5g脱脂乳粉得到)、5％脱脂奶粉(100mlpbst加入5g脱脂乳粉得到)、7.5％脱脂奶粉(100mlpbst加入7.5g脱脂乳粉得到)；优选的为5％脱脂奶粉。

23、进一步，所述洗涤液为pbst(8.0g nacl、0.2g kcl、2.86g na2hpo4·12h2o、0.27gkh2po4和0.5ml吐温-20加去离子水至1000ml得到)。

24、进一步，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗猪igg(igg-hrp)(购自kpl公司)。

25、进一步，所述酶标二抗的稀释度为1:12500。

26、进一步，所述底物显色液为tmb底物显色液(购自上海生物工程有限公司，货号e661007)。

27、进一步，所述终止液为0.5m h2so4(13.6ml浓硫酸缓慢滴入400ml去离子水中，补齐体积至500ml得到)。

28、上述猪源嗜血支原体抗体间接elisa检测试剂盒在检测猪源嗜血支原体抗体中的应用也在本发明的保护范围之内。

29、第四方面，本发明提供了一种猪源嗜血支原体抗体间接elisa检测方法，包括如下步骤：

30、1)包被抗原：以上述重组mh-dnak蛋白作为包被抗原用包被液包被酶标板，洗涤剂洗涤；

31、2)封闭：加入封闭液，封闭，洗涤剂洗涤；

32、3)加血清：加入待测动物的血清，反应，洗涤剂洗涤；

33、4)加酶标二抗：加入酶标二抗，反应，洗涤剂洗涤；

34、5)tmb显色：加入底物显色液，反应；

35、6)反应终止：加入终止液，终止反应；

36、7)检测od450值：用酶标仪测定各待测动物的血清的od450值；

37、8)结果判读：判定标准为od450值>0.358者判为阳性(即待测动物的血清为猪源嗜血支原体阳性血清，也就是说待测动物的血清含有猪源嗜血支原体抗体或待测动物感染或感染过猪源嗜血支原体)，od450值<0.275者判为阴性(即待测动物的血清为猪源嗜血支原体阴性血清，也就是说待测动物的血清不含有猪源嗜血支原体抗体或猪源嗜血支原体抗体水平低于检测下限)，0.275≤od450值≤0.358者判为可疑(即待测动物的血清疑似为猪源嗜血支原体阳性血清，也就是说待测动物的血清疑似含有猪源嗜血支原体抗体或待测动物疑似感染或感染过猪源嗜血支原体)。

38、在本发明中通过对包被浓度、封闭液、封闭时间、血清最佳稀释度\血清反应时间、酶标二抗作用时间和显色时间进行优化，得到了最佳包被浓度为0.44μg/ml，最佳封闭液为5％脱脂奶粉，最佳封闭时间为1h，血清最佳稀释度为1：40，血清最佳反应时间为1h、酶标二抗最佳反应时间为0.5h，底物显色液最佳反应时间为7min。

39、在本发明优选的实施方式中，所述猪源嗜血支原体抗体间接elisa检测方法，包括如下步骤：

40、1)包被抗原：以上述重组mh-dnak蛋白作为包被抗原用ph9.6 0.01m的碳酸盐缓冲液以0.44μg/ml的包被浓度，100ul/孔，于37℃温育1h后放置于4℃过夜包被酶标板，用pbst洗涤3次，每次3min；

41、2)封闭：加入250μl 5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，pbst洗涤1次；

42、3)加血清：加入稀释度为1：40的待测动物的血清，100μl/孔，37℃反应1h，pbst洗涤3次；

43、4)加酶标二抗：加入稀释度为1：12500的辣根过氧化物酶标记羊抗猪igg，100μl/孔，37℃反应0.5h，pbst洗涤3次；

44、5)tmb显色：加入tmb底物，100μl/孔，反应7min；

45、6)反应终止：加入0.5m h2so4，50μl/孔，终止反应；

46、7)检测od450值：用酶标仪在测定各待测动物的血清的od450值；

47、8)结果判读：判定标准为od450值>0.358者判为阳性(即待测动物的血清为猪源嗜血支原体阳性血清，也就是说待测动物的血清含有猪源嗜血支原体抗体或待测动物感染或感染过猪源嗜血支原体)，od450值<0.275者判为阴性(即待测动物的血清为猪源嗜血支原体阴性血清，也就是说待测动物的血清不含有猪源嗜血支原体抗体或猪源嗜血支原体抗体水平低于检测下限)，0.275≤od450值≤0.358者判为可疑(即待测动物的血清疑似为猪源嗜血支原体阳性血清，也就是说待测动物的血清疑似含有猪源嗜血支原体抗体或待测动物疑似感染或感染过猪源嗜血支原体)。

48、在本发明中，所述猪源嗜血支原体为早期鉴定的猪支原体(mycoplasma suis，m.suis)、微小支原体(mycoplasma parvum，m.parvum)和/或猪嗜血支原体(mycoplasmahaemosuis，m.haemosuis)。所述待测动物为猪。

49、本发明的有益效果如下：

50、本发明基于重组mh-dnak蛋白建立了猪源嗜血支原体抗体间接elisa检测方法用于检测猪源嗜血支原体抗体水平，与部分其他猪病血清无交叉反应，具有良好的特异性和重复性，为mycoplasma suis、mycoplasma parvum和mycoplasma haemosuis的临床诊断、流行病学研究和免疫检测提供有效的手段。