藏南杜鹃多糖及其制备方法与应用

本发明属于中药，涉及多糖，尤其是涉及藏南杜鹃多糖及其制备方法与应用。

背景技术：

1、补体系统是人体免疫系统的重要组成部分，但是当补体系统过度激活是则会引起人体免疫系统的过度反应，造成人体自身正常组织的损伤，如类风湿性关节炎、老年性痴呆、系统性红斑狼疮(sle)以及缺血性再灌注、急性心肌梗死、急性呼吸窘迫综合征(ards)、多器官功能衰竭综合症等急性疾病的发病过程中，补体的过度激活都起了重要作用。目前临床上使用的糖皮质激素等免疫抑制剂并非专一的补体抑制剂，且易产生多种并发症和副作用，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。

2、炎症(inflammation)反应是一个高度复杂的宿主病理生理反应过程，是一种自然防御反应，旨在清除病原体从而减轻组织损伤，但急性炎症反应会在短时间内引发大面积中性粒细胞浸润，形成局部炎症中心，导致不同程度的组织损伤。全身炎症反应综合征(sirs)是由感染、创伤、缺血再灌注等原因诱发的系统性炎症反应，多表现为补体系统过度激活、过度氧化应激等因素引发中性粒细胞炎性浸润，形成细胞因子风暴(cytokinestorm)，过度释放的炎症细胞因子作用于内皮细胞会影响脏器内微循环，进一步导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome)，最终导致患者死亡(bonerc.jama，1992；268:3452-3455)。补体系统与炎症反应密切相关，补体系统的过度激活是全身炎症反应综合征的重要症状与诱因之一，因此，补体抑制剂可以作为治疗炎症的潜在药物。

3、由于补体抑制为炎症潜在的治疗靶点之一，因此，将高效低毒的补体抑制剂开发为抗炎药物具有重要意义。多糖具有高效、低毒等特点，已有报道从药用植物中分离得到具有良好抗炎活性的抗补体活性多糖(chen my,li h,lu xx,ling lj,weng hb,sun w,chendf,zhang yy.chin j nat med，2019，17:187-197)。由于海拔与位置等因素，西藏地区形成了独特的藏药体系，许多藏药对免疫系统有明显的调节作用，是寻找补体抑制剂和抗炎药物前体的宝贵资源。

4、藏南杜鹃(rhododendron principis bur.et franch.)是杜鹃花科杜鹃属常绿小乔木，广泛分布在西藏东部和南部。传统藏药中，藏南杜鹃的枝、叶被用作“达玛”，收载于《晶珠本草》中，具有燥体脓血之功效，用于治疗肺炎等炎症相关疾病。但目前，尚未有对藏南杜鹃多糖的结构、抗补体活性与抗炎活性的相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的就是基于现有技术的现状，提供具有抗补体活性与抗炎活性成分，具体涉及藏南杜鹃多糖及其制备方法与应用，尤其是藏南杜鹃90醇沉多糖(zndcp-90)和四个藏南杜鹃均一多糖(zndhp-1、zndhp-2、zndhp-3、zndhp-4)及其制备方法和在制备补体抑制剂药物和抗炎药物中的应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案之一为提供藏南杜鹃多糖，包括藏南杜鹃90醇沉多糖zndcp-90和四个藏南杜鹃均一多糖zndhp-1、zndhp-2、zndhp-3、zndhp-4，分别具有以下结构特征：

4、藏南杜鹃90醇沉多糖zndcp-90：七种单糖组成的多糖，分子量范围为353.2-2208.5kda；总糖含量为64.31％、蛋白含量为1.94％、糖醛酸含量为1.31％；单糖摩尔比甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖醛酸：半乳糖：木糖：阿拉伯糖＝11.22：2.20：16.22：24.33：9.66：24.59：11.78；

5、藏南杜鹃均一多糖zndhp-1：五种单糖组成的多糖，分子量为633.8kda；总糖含量为91.69％、蛋白含量为1.01％、糖醛酸含量为1.68％；单糖摩尔比甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝9.85：9.05：56.02：15.99：9.10；连接方式包括末端连接阿拉伯糖、末端连接鼠李糖、1,3-连接鼠李糖、末端连接葡萄糖、末端连接半乳糖、1,5-连接阿拉伯糖、1,3-连接葡萄糖、1,4-连接葡萄糖、1,4-连接半乳糖、1,4-连接甘露糖、1,3,5-连接阿拉伯糖、1,2,6-连接葡萄糖、1,2,4-连接葡萄糖、1,4,6-连接半乳糖、1,4,6-连接甘露糖、1,3,6-连接葡萄糖、1,3,6-连接甘露糖，摩尔比分别为2.21：6.03：5.02：17.59：2.58：2.21：2.04：25.74：1.98：2.97：5.69：3.75：3.36：8.78：2.87：2.54：4.64；

6、藏南杜鹃均一多糖zndhp-2：五种单糖组成的多糖，分子量为599.7kda；总糖含量为94.31％、蛋白含量为1.31％、糖醛酸含量为1.01％；单糖摩尔比甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝2.21：5.96：48.34：16.98：26.51；连接方式包括末端连接阿拉伯糖、末端连接鼠李糖、1,3-连接阿拉伯糖、1,3-连接鼠李糖、末端连接葡萄糖、1,5-连接阿拉伯糖、1,2-连接葡萄糖、1,4-连接葡萄糖、1,3,5-连接阿拉伯糖、1,2,6-连接葡萄糖、1,2,6-连接半乳糖、1,3,6-连接半乳糖、1,3,6-连接葡萄糖、1,4,6-连接甘露糖，摩尔比分别为14.01：2.79：2.21：1.98：11.04：6.90：25.98：1.88：9.45：5.79：10.06：1.79：3.15：2.97；

7、藏南杜鹃均一多糖zndhp-3：五种单糖组成的多糖，分子量为651.5kda；总糖含量为92.14％、蛋白含量为1.98％、糖醛酸含量为1.08％；单糖摩尔比甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝1.67：1.94：71.85：11.30：13.24；连接方式包括末端连接阿拉伯糖、1,3-连接鼠李糖、1,5-连接阿拉伯糖、末端连接葡萄糖、1,3,5-连接阿拉伯糖、1,4-连接葡萄糖、1,4-连接半乳糖、1,4,6-连接半乳糖、1,3,6-连接甘露糖，摩尔比分别为3.24：2.21：2.29：25.93：7.14：46.99：2.33：7.16：2.71；

8、藏南杜鹃均一多糖zndhp-4：三种单糖组成的多糖，分子量为691.9kda；总糖含量为90.87％、蛋白含量为1.65％、糖醛酸含量为0.87％；单糖摩尔比葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝65.18：10.11：24.71；连接方式包括末端连接阿拉伯糖、1,5-连接阿拉伯糖、末端连接葡萄糖、1,3,5-连接阿拉伯糖、1,4-连接葡萄糖、1,4-连接半乳糖、1,4,6-连接葡萄糖、1,3,6-连接葡萄糖，摩尔比分别为7.17：4.89：11.87：7.24：46.69：7.82：7.43：6.89。

9、本发明的技术方案之二为提供藏南杜鹃多糖的制备方法，包括如下步骤：

10、s1、取藏南杜鹃的叶片，并依次经过乙醇提取、过滤、烘干，烘干后的残渣用热水提取、过滤、浓缩、一次静置、离心，离心后的上清液浓缩、二次静置、离心，离心后的沉淀加水复溶，加入三氯乙酸离心，离心后的上清液调ph至中性，并依次进行浓缩、透析、冷冻干燥，得到藏南杜鹃90醇沉多糖zndcp-90；

11、s2、将步骤s1制备得到的藏南杜鹃90醇沉多糖zndcp-90加水溶解，分次用deae-cellulose柱色谱分离，依次用蒸馏水和梯度浓度的nacl溶液洗脱，收集各流份，根据各流份糖含量显色反应的紫外检测结果，合并流份依次浓缩、透析、冷冻干燥，经高效液相色谱检测均一度与抗补体活性检测，得到藏南杜鹃均一多糖zndhp-1、藏南杜鹃均一多糖zndhp-2、藏南杜鹃均一多糖zndhp-3和藏南杜鹃均一多糖zndhp-4。

12、进一步地，步骤s1中，通过质量分数为95％的乙醇提取藏南杜鹃的叶片。

13、进一步地，步骤s1中，一次静置前加入质量分数为95％的乙醇使得一次静置时提取溶液中的乙醇浓度为75％。

14、进一步地，步骤s1中，二次静置前加入无水乙醇使得二次静置时上清液中的乙醇浓度为90％。

15、进一步地，步骤s1中，加入三氯乙酸后使得溶液中三氯乙酸的浓度为10％。

16、进一步地，步骤s2中，nacl溶液的梯度浓度依次为0.1mol/l、0.2mol/l、0.4mol/l、0.8mol/l、1.6mol/l。

17、本发明的技术方案之三为提供藏南杜鹃多糖的应用，所述藏南杜鹃多糖用于制备抗补体药物。

18、进一步地，所述抗补体药物为抑制补体经典途径激活所引发的细胞溶血的药物。

19、本发明的技术方案之四为提供藏南杜鹃多糖的应用，所述藏南杜鹃多糖用于制备抗炎药物。

20、进一步地，所述抗炎药物为抑制脂多糖诱导分泌炎症因子的药物。

21、更进一步地，所述抗炎药物为抑制脂多糖引发肺炎的药物。

22、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

23、本发明对藏南杜鹃的叶中分离得到5个藏南杜鹃多糖即1个藏南杜鹃90醇沉多糖zndcp-90及4个藏南杜鹃均一多糖zndhp-1、zndhp-2、zndhp-3、zndhp-4，经体外实验证实藏南杜鹃多糖均具有显著的补体抑制活性，可进一步作为活性成分用于制备抗补体药物；经体内试验证实zndcp-90、zndhp-2、zndhp-3、zndhp-4具有显著的抑制炎症反应，可进一步作为活性成分用于制备抗炎药物。