一种大肠杆菌培养基、其制备方法及应用与流程

本发明涉及微生物培养基领域，更具体涉及大肠杆菌培养基、其制备方法及应用。

背景技术：

1、大肠杆菌是寄居在人体大肠中的一类普通的原核生物，因其能够方便的易于培养和传代且生长速度快，营养需求简单等优势，并具备完善的基因组序列信息和清晰的遗传学背景，目前被广泛的基因工程、生物能源、微生物工业等研究中。因此，获得高生物量和高活性的大肠杆菌是很多科研工作者们研究的一大热点。

2、培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。选择合适的培养基，使之既能满足微生物生长的需要，又能获得高产的产品，同时也要符合增产节约、因地制宜的原则。

3、现有技术中，常使用lb(luria broth)、sob(super optimal broth)、soc(superoptimal broth with catabolite repression)、tb(terrific broth)等培养基用于大肠杆菌的扩增培养，具有成本高、不易大批量配制、培养基成分不明确(如应用胰蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉膏等成分复杂原料)等缺点。近年来，也有一些以特定产物产量为目标的培养基，例如cn108048501 a、cn114381476a都披露了以l-苏氨酸的产量/产率为主要关注目标的大肠杆菌用培养基，主要成分包括葡萄糖、玉米浆、酵母粉、钴胺素、牛肉膏等；cn101323840a公开了用于生产l-色氨酸的escherichia coli k-12w3110用培养基，在tc溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂等。但发酵产生l-苏氨酸、l-色氨酸仅仅是大肠杆菌工业应用中的部分用途，在上述发酵过程中，代谢副产物乙酸和nh4+等的过量累积会对菌体生长、菌体活力和产酸产生严重影响，因此这类培养基的应用范围极为有限，仅使用于以相应产物为目标的大肠杆菌在工业量产阶段的应用，对于处于需要提高生长活力、提高增殖效率阶段的菌体，上述培养基并不能起到良好的培养效果。此外，如cn105238718a等的专利申请中公开了大肠杆菌的多级培养方法，分别用三种不同组成的培养基培养大肠杆菌，得到一级、二级和三级培养种子，这样的培养方法虽然考虑到了不同阶段菌种所需的不同营养物质，但进行该种分级培养需要分别配制三种组分完全不同的培养基，不同阶段的培养基或组分不可混用，且一级、二级培养基中依然添加了酵母提取物等成分复杂的物质。成分复杂物质的应用，往往导致培养基中存在大量悬浮颗粒而呈现轻微浑浊状态，如果感染其它杂菌，不能及时通过液体澄清度进行判断，从而可能对目标菌群的培养带来损失。

技术实现思路

1、本发明基于上述现有技术中的缺陷，意在提供一种用于大肠杆菌诱导表达前的培养基，以获得更高的生物量和菌体活力，为外源蛋白的高效表达打下基础，主要适用于≤6l摇瓶阶段或相近规模的小型生物反应器。

2、相较于现有技术中的培养基，例如前述列举的类型，本发明中适用的氮源是大豆低分子多肽，以非转基因大豆为原料，经过酶解后干燥获得的黄色粉末状物质，含有多种低分子的大豆多肽、氨基酸和植物源营养因子，更易提供给大肠杆菌所需的氮源等；且本发明培养基并未添加上述几种培养基中成分尚不明确的酵母提取物、牛肉膏、胰蛋白胨等，而是选用化学成分明确的营养物质作为培养基成分。

3、此外，本发明培养基配制方便，并依据组成的具体不同，可进一步分为高密度型大肠杆菌培养基以及高密度经济型大肠杆菌培养基，其中高密度型大肠杆菌培养基可提供高生物量和高菌体活力的培养结果，高密度经济型大肠杆菌培养基可在兼顾培养基成本经济性前提下提供较高生物量和较高菌体活力的培养结果。

4、本发明提供一种大肠杆菌培养基，由以下原料组成：葡萄糖13-28g/l，大豆低分子多肽10-30g/l，无水氯化钙0.10-0.20g/l，肌醇0.010-0.02g/l，硫酸5-10g/l，无水硫酸镁0.50-1.00g/l，氯化钠0.10-0.20g/l，磷酸二氢钾1.00-2.10g/l，生物素溶液5-20ml/l，余量为溶剂(纯化水/注射用水)。

5、本发明提供的大肠杆菌培养基中的生物素溶液，其组成及含量如下：生物素0.5-0.6g/l，维生素b1 12-15g/l，维生素b2 12-15g/l，维生素b6 12-15g/l，余量为溶剂。所述溶剂为纯化水/注射用水。

6、本发明提供的一种大肠杆菌培养基可进一步分为以下两种类型：高密度型培养基和高密度经济型培养基；其中，高密度型大肠杆菌培养基中碳源、氮源及其它多种营养物质的浓度更高，可高效供给菌群保持高活力所需物质，提供高生物量和高菌体活力的培养结果；高密度经济型培养基则通过试验获得了多种组分的较低浓度配比组成，但仍具有高效维持实现菌群活力的效果，同时进一步降低成本，最适宜批量生产应用，实现生产收益最大化。

7、作为本发明的优化方案，高密度型培养基的组成如下：葡萄糖25-28g/l，大豆低分子多肽26-30g/l，无水氯化钙0.19-0.20g/l，肌醇0.018-0.02g/l，硫酸铵9.5-10g/l，无水硫酸镁0.95-1.00g/l，氯化钠0.18-0.20g/l，磷酸二氢钾1.94-2.10g/l，生物素溶液10-12ml/l，余量为溶剂。

8、更优选地，本发明的高密度型培养基的组成如下：葡萄糖26g/l，大豆低分子多肽26g/l，无水氯化钙0.19g/l，肌醇0.02g/l，硫酸铵9.5g/l，无水硫酸镁0.95g/l，氯化钠0.18g/l，磷酸二氢钾1.94g/l，生物素溶液10ml/l，余量为溶剂。

9、作为本发明的优化方案，高密度经济型培养基的组成如下：葡萄糖13.0-14.5g/l，大豆低分子多肽10-14.5g/l，无水氯化钙0.10-0.012g/l，肌醇0.010-0.011g/l，硫酸铵5.00-5.35g/l，无水硫酸镁0.50-0.53g/l，氯化钠0.10-0.11g/l，磷酸二氢钾1.0-1.1g/l，生物素溶液10-11ml/l，余量为溶剂。

10、更优选地，本发明的高密度型培养基的组成如下：葡萄糖14.3g/l，大豆低分子多肽14.3g/l，无水氯化钙0.10g/l，肌醇0.011g/l，硫酸铵5.35g/l，无水硫酸镁0.53g/l，氯化钠0.11g/l，磷酸二氢钾1.1g/l，生物素溶液10ml/l，余量为溶剂。

11、作为本发明培养基中高密度型培养基和高密度经济型培养基中的生物素溶液，其优选的组成如下：生物素0.5-0.6g/l，维生素b1 14-15g/l，维生素b214-15g/l，维生素b614-15g/l，余量为溶剂。

12、更优选地，生物素溶液组成如下：生物素0.56g/l，维生素b1 14g/l，维生素b214g/l，维生素b6 14g/l，余量为溶剂。

13、本发明大肠杆菌培养基，其所含的原料主要作用如下：

14、葡萄糖：常见形式包括一水合葡萄糖(dextrose monohydrate)(化学式c6h12o6·h2o)可作为微生物利用的快速碳源。

15、大豆低分子多肽：大豆多肽也称肽基大豆蛋白水解物，是大豆蛋白质经蛋白酶作用得到的蛋白质水解产物，是平均肽链长度为23 10的短肽(以233的低分子肽为主)，以分子质量低于1 000da的多肽为主体，并通常含有少量大分子多肽、游离氨基酸、糖类和无机盐成分。大豆多肽的相对分子质量大小、肽链长短以及各种理化性质由所选用的酶类、水解条件和分离方法而定。本发明使用相对分子质量≤1 000da的低盐大豆低分子多肽作为微生物利用的植物源氮源，大豆低分子多肽保留了大豆蛋白的营养特性，但更容易被微生物摄取、利用，有利于菌类生长繁殖。

16、无水氯化钙：无水氯化钙(anhydrous calcium chloride)(化学式cacl2)，可为微生物提供钙离子。

17、肌醇：肌醇(inositol)(化学式c6h6o6)，可作为微生物生长因子。

18、硫酸铵：硫酸铵(ammonium sulphate)(化学式(nh4)2so4)，可为微生物提供铵离子。

19、无水硫酸镁：无水硫酸镁(magnesium sulfate anhydrous)(化学式mgso)，可为微生物提供镁离子。

20、氯化钠：氯化钠(sodium chloride)(化学式nacl)，可为微生物提供钠离子。

21、磷酸二氢钾：磷酸二氢钾(potassium dihydrogen phosphate)(化学式kh2po4)，可为微生物提供磷酸根离子和钾离子。

22、本发明的另一个目的是提供一种大肠杆菌培养基的制备方法，包括以下步骤：

23、按上述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料；

24、将葡萄糖、大豆低分子多肽、肌醇，用不低于40℃的溶剂溶解得到组分a溶液，室温待用；

25、将无水氯化钙，用溶剂充分溶解后为组分b溶液，室温待用；

26、将硫酸铵，无水硫酸镁，氯化钠，磷酸二氢钾，使用溶剂充分溶解后为组分c溶液，室温待用；

27、将生物素，维生素b1，维生素和维生素b6，使用溶剂充分溶解后为生物素溶液；

28、将上述所述组分a、b、c溶液分别使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤后；合并后使用无菌氢氧化钠溶液将其ph值调节在6.8-7.0范围内，为溶液d；

29、将生物素溶液使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤；

30、将无菌溶液d与除菌后的生物素溶液合并混匀后，即为大肠杆菌培养基。

31、本发明的另一个目的是提供一种大肠杆菌的培养方法，包括以下步骤：

32、复苏种子液的制备：在无菌条件下，取大肠杆菌接种于大肠杆菌复苏培养基中，在37℃、220rpm恒温摇床中培养24h，得种子培养液；

33、扩增培养：在无菌条件下，取2代次复苏种子培养液接种于本发明的大肠杆菌培养基中，在35339℃、2303270rpm恒温摇床中培养24h，得大肠杆菌菌液。

34、本发明中大肠杆菌培养步骤中，第0代次复苏种子液的制备中大肠杆菌接种量为0.2ml，第1代次复苏种子液的制备中大肠杆菌接种量为0.2ml，扩增培养液接种量为1ml。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、本发明培养基添加的蛋白胨是大豆低分子多肽，更易提供给大肠杆菌所需的氮源等；且本发明培养基选用化学成分明确的营养物质作为培养基成分，避免了复杂的不明成分对菌群活力、易观察程度带来的负面影响。本发明培养基能够满足大肠杆菌的高生物量和较高菌体活力的培养扩增需求，适用于≤6l摇瓶阶段或相近规模的小型生物反应器的培养规模，合理调节大肠杆菌的代谢负荷，维持菌群高生物量和高活力，为外源蛋白的高效表达打下基础。其中，高密度型大肠杆菌培养基可提供高生物量和高菌体活力的培养结果，高密度经济型大肠杆菌培养基可在兼顾培养基成本经济性前提下提供较高生物量和较高菌体活力的培养结果。