OsRFS蛋白及其应用

本发明属于生物，具体涉及osrfs蛋白及其应用。

背景技术：

1、环境中的非生物胁迫，例如干旱、盐碱、冷害和热害等影响植物的生长和发育，造成农作物的减产，也影响林木、果树、花卉、园艺观赏植物的正常生长和品质，培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。

2、植物为了适应盐胁迫等不利环境条件形成了一系列复杂的响应逆境胁迫的调控机制。已有研究表明，植物抗逆的机制虽然复杂，但是可以被调控。

3、分蘖作为禾本科植物特有的分枝形式，影响水稻株型，与水稻产量密切相关。对其他禾本科植物，如小麦、稻米、玉米、大麦和高粱，分蘖性状也备受关注，各国学者从多方面研究调控分蘖的多种因素。

4、株高是水稻品种的一个十分重要的农艺性状之一。植株过高容易引起倒伏减产，适当矮化则耐肥，抗倒，增产。矮化育种是水稻育种的一个重大突破，矮秆良种的选育和推广显著提高了水稻的生产潜力。因此，株高一直是水稻遗传研究的重点之一。水稻株高由复杂的基因调控网络控制。根据目前的报道，株高主要受激素如赤霉素(gibberellin，ga)、油菜素内酯(brassinosteroid，br)、独脚金内酯(strigolactone，sl)等相关途径和极性生长素运输(polar auxin transport)的调控，其中ga和br相关途径研究最为深入。多数矮化突变体的产生都是由于这两种植物激素的生物合成或响应途径的缺陷；随着ga受体gid1(ga-insensitive dwarf1)、gid2(ga-insensitive dwarf 2)和della等关键蛋白的相继鉴定，ga控制植物株型建成的信号途径得以阐明。

5、水稻(oryza sativa l.)是我国重要的粮食作物之一，其可持续生产对保障我国粮食安全具有重要意义。水稻种植过程中会遭受干旱、淹涝、盐害、低温、高温等的非生物胁迫。因此，鉴定水稻耐逆相关基因及其机制，通过基因工程对水稻自身品种及其他物种的抗逆性改良具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供osrfs蛋白的应用。

2、本发明第二方面的目的，在于提供sgrna。

3、本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第二方面的sgrna相关的生物材料。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种crispr/cas系统。

5、本发明第五方面的目的，在于提供一种试剂。

6、本发明第六方面的目的，在于提供一种方法。

7、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

8、本发明的第一个方面，提供osrfs蛋白在a1)～a3)至少一项中的应用：a1)调控植物的非生物胁迫抗性；a2)调控植物的株高；a3)调控植物的分蘖数。

9、osrfs蛋白抑制剂在b1)～b8)中至少一项中的应用：b1)降低植物的非生物胁迫抗性；b2)降低植物的株高；b3)提高植物的分蘖数；b4)培育植物品种；b5)制备降低植物的非生物胁迫抗性的产品；b6)制备降低植物的株高的产品；b7)制备提高植物的分蘖数的产品；b8)制备培育植物品种的产品；

10、所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性降低；(2)株高降低；(3)分蘖数提高。

11、优选地，所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性相对于参考水平降低；(2)株高相对于参考水平降低；(3)分蘖数相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

12、优选地，所述osrfs蛋白抑制剂包含抑制osrfs蛋白活性的物质、降解osrfs蛋白的物质、降低osrfs蛋白表达水平的物质中的至少一种；进一步包含抑制osrfs蛋白活性的物质。

13、优选地，所述降低osrfs蛋白表达水平的物质包含c1)～c13)中至少一种：c1)靶向osrfs蛋白的sirna、dsrna、mirna、核酶、shrna、crispr/cas系统中的至少一种；c2)编码c1)的核酸分子；c3)包含c2)所述核酸分子的表达盒；c4)包含c2)所述核酸分子的重组载体；c5)包含c3)所述表达盒的重组载体；c6)包含c2)所述核酸分子的转基因细胞；c7)包含c3)所述表达盒的转基因细胞；c8)包含c4)所述重组载体的转基因细胞；c9)包含c5)所述重组载体的转基因细胞；c10)含有c2)所述核酸分子的重组微生物；c11)含有c3)所述表达盒的重组微生物；c12)含有c4)所述重组载体的重组微生物；c13)含有c5)所述重组载体的重组微生物。

14、优选地，所述重组载体包含prgeb32。

15、优选地，所述重组微生物包含农杆菌；进一步包含根癌农杆菌。

16、优选地，所述osrfs蛋白抑制剂包含靶向osrfs蛋白的crispr/cas系统，所述crispr/cas系统包含sgrna；

17、所述sgrna的核苷酸序列包含d1)～d6)中任一种：d1)seq id no.7；d2)将seq idno.7经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.7所示的sgrna具有相同功能的核苷酸序列；d3)与seq id no.7具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与seq id no.7所示的sgrna具有相同功能的核苷酸序列；d4)seq id no.8；d5)将seq id no.8经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.8所示的sgrna具有相同功能的核苷酸序列；d6)与seq id no.8具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与seq id no.8所示的sgrna具有相同功能的核苷酸序列。

18、优选地，所述靶向osrfs蛋白的crispr/cas系统还包含cas蛋白和/或与cas蛋白相关的生物材料；所述生物材料包含：k1)～k12)中至少一种：k1)编码cas蛋白的核酸分子；k2)包含k1)所述核酸分子的表达盒；k3)包含k1)所述核酸分子的重组载体；k4)包含k2)所述表达盒的重组载体；k5)包含k1)所述核酸分子的转基因细胞；k6)包含k2)所述表达盒的转基因细胞；k7)包含k3)所述载体的转基因细胞；k8)包含k4)所述载体的转基因细胞；k9)含有k1)所述核酸分子的重组微生物；k10)含有k2)所述表达盒的重组微生物；k11)含有k3)所述重组载体的重组微生物；k12)含有k4)所述重组载体的重组微生物。

19、优选地，所述cas蛋白包含cas9蛋白。

20、e1)～e3)在f1)～f6)中至少一项中的应用：e1)osrfs蛋白；e2)与osrfs蛋白相关的生物材料；e3)靶向上调osrfs蛋白的表达量和/或增强osrfs蛋白活性的试剂；f1)提高植物的非生物胁迫抗性；f2)降低植物的株高；f3)培育植物品种；f4)制备提高植物的非生物胁迫抗性的产品；f5)制备降低植物的株高的产品；f6)制备培育植物品种的产品；

21、所述生物材料包含g1)～g12)中的至少一种：g1)编码osrfs蛋白的核酸分子；g2)含有g1)所述核酸分子的表达盒；g3)含有g1)所述核酸分子的重组载体；g4)含有g2)所述表达盒的重组载体；g5)含有g1)所述核酸分子的重组细胞；g6)含有g2)所述表达盒的重组细胞；g7)含有g3)所述重组载体的重组细胞；g8)含有g4)所述重组载体的重组细胞；g9)含有g1)所述核酸分子的重组微生物；g10)含有g2)所述表达盒的重组微生物；g11)含有g3)所述重组载体的重组微生物；g12)含有g4)所述重组载体的重组微生物；

22、所述植物品种包含(4)～(5)中至少一种特征：(4)非生物胁迫抗性提高；(5)株高降低。

23、优选地，所述植物品种包含(4)～(5)中至少一种特征：(4)非生物胁迫抗性相对于参考水平提高；(5)株高相对于参考水平降低。

24、优选地，所述重组载体包含pbi121系列载体、pcambia系列载体、pylox.5中的至少一种；进一步包含pylox.5。

25、优选地，所述重组载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它效应mrna加工或基因表达的dna片段。

26、优选地，所述重组载体还包含任何一种强启动子或诱导型启动子。

27、优选地，所述强启动子或诱导型启动子包括但不限于泛素(ubiqutin)启动子和花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子，它可单独使用或与其他的植物启动子结合使用。

28、优选地，所述重组载体还包含增强子。

29、优选地，所述增强子的区域包括但不限于atg起始密码子和邻接区域。起始密码子必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或来自结构基因。

30、优选地，所述重组载体还包含可选择性标记。

31、优选地，所述可使用的选择性标记包括编码抗除草剂的酶的基因或具有抗性的抗生素标记物；所述的除草剂包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等。从转基因植物的安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

32、优选地，所述编码osrfs蛋白的核酸分子的序列为h1)～h6)中任一种：h1)如seqid no.3所示；h2)将seq id no.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.3具有相同功能的核甘酸序列；h3)与seq id no.3具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与seq idno.3具有相同功能的核苷酸序列；h4)如seqid no.4所示；h5)将seq id no.4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.4具有相同功能的核甘酸序列；h6)与seq id no.4具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与seq id no.4具有相同功能的核苷酸序列。

33、优选地，所述植物包含禾本科植物；进一步包含水稻。

34、优选地，所述非生物胁迫包含干旱胁迫、盐胁迫、aba胁迫、meja胁迫、peg胁迫、低温胁迫、热胁迫中的至少一种；进一步包含干旱胁迫、盐胁迫中的至少一种；更进一步包含干旱胁迫和盐胁迫。

35、优选地，所述osrfs蛋白为c1)～c3)中任一种；c1)氨基酸序列如seq id no.16所示的osrfs蛋白；c2)将seq id no.16经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.16具有相同功能的osrfs蛋白；c3)与seq id no.16具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与seq id no.16具有相同功能的osrfs蛋白。

36、本发明的第二个方面，提供sgrna，所述sgrna的核苷酸序列包含d1)～d6)中任一种：d1)seq idno.7；d2)将seq id no.7经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.7所示的sgrna具有相同功能的核苷酸序列；d3)与seq id no.7具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与seq id no.7所示的sgrna具有相同功能的核苷酸序列；d4)seq id no.8；d5)将seq idno.8经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.8所示的sgrna具有相同功能的核苷酸序列；d6)与seq id no.8具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与seq id no.8所示的sgrna具有相同功能的核苷酸序列。

37、优选地，所述sgrna用于i1)～i4)中至少一种：i1)降低植物的非生物胁迫抗性；i2)降低植物的株高；i3)提高植物的分蘖数；i4)培育植物品种；

38、所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性降低；(2)株高降低；(3)分蘖数提高。

39、优选地，所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性相对于参考水平降低；(2)株高相对于参考水平降低；(3)分蘖数相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

40、优选地，所述植物包含禾本科植物；进一步包含水稻。

41、优选地，所述非生物胁迫包含干旱胁迫、盐胁迫、aba胁迫、meja胁迫、peg胁迫、低温胁迫、热胁迫中的至少一种；进一步包含干旱胁迫、盐胁迫中的至少一种；更进一步包含干旱胁迫和盐胁迫。

42、本发明第三个方面，提供与本发明第二个方面的sgrna相关的生物材料，所述生物材料包含j1)～j12)中至少一种：j1)编码本发明第二个方面的sgrna的核酸分子；j2)包含j1)所述核酸分子的表达盒；j3)包含j1)所述核酸分子的重组载体；j4)包含j2)所述表达盒的重组载体；j5)包含j1)所述核酸分子的转基因细胞；j6)包含j2)所述表达盒的转基因细胞；j7)包含j3)所述载体的转基因细胞；j8)包含j4)所述载体的转基因细胞；j9)含有j1)所述核酸分子的重组微生物；j10)含有j2)所述表达盒的重组微生物；j11)含有j3)所述重组载体的重组微生物；j12)含有j4)所述重组载体的重组微生物。

43、优选地，所述转基因细胞不包含繁殖材料。

44、优选地，所述生物材料用于i1)～i4)中至少一种：i1)降低植物的非生物胁迫抗性；i2)降低植物的株高；i3)提高植物的分蘖数；i4)培育植物品种；

45、所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性降低；(2)株高降低；(3)分蘖数提高。

46、优选地，所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性相对于参考水平降低；(2)株高相对于参考水平降低；(3)分蘖数相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

47、优选地，所述重组载体包含prgeb32。

48、优选地，所述重组微生物包含农杆菌；进一步包含根癌农杆菌。

49、优选地，所述植物包含禾本科植物；进一步包含水稻。

50、优选地，所述非生物胁迫包含干旱胁迫、盐胁迫、aba胁迫、meja胁迫、peg胁迫、低温胁迫、热胁迫中的至少一种；进一步包含干旱胁迫、盐胁迫中的至少一种；更进一步包含干旱胁迫和盐胁迫。

51、本发明的第四个方面，提供一种crispr/cas系统，包含本发明第二个方面的sgrna和/或本发明第三个方面的生物材料。

52、优选地，所述crispr/cas系统还包含：cas蛋白和/或与cas蛋白相关的生物材料；所述生物材料包含：k1)～k12)中至少一种：k1)编码cas蛋白的核酸分子；k2)包含k1)所述核酸分子的表达盒；k3)包含k1)所述核酸分子的重组载体；k4)包含k2)所述表达盒的重组载体；k5)包含k1)所述核酸分子的转基因细胞；k6)包含k2)所述表达盒的转基因细胞；k7)包含k3)所述载体的转基因细胞；k8)包含k4)所述载体的转基因细胞；k9)含有k1)所述核酸分子的重组微生物；k10)含有k2)所述表达盒的重组微生物；k11)含有k3)所述重组载体的重组微生物；k12)含有k4)所述重组载体的重组微生物。

53、优选地，所述cas蛋白包含cas9蛋白。

54、优选地，所述系统用于i1)～i4)中至少一种：i1)降低植物的非生物胁迫抗性；i2)降低植物的株高；i3)提高植物的分蘖数；i4)培育植物品种；

55、所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性降低；(2)株高降低；(3)分蘖数提高。

56、优选地，所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性相对于参考水平降低；(2)株高相对于参考水平降低；(3)分蘖数相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

57、优选地，所述植物包含禾本科植物；进一步包含水稻。

58、优选地，所述非生物胁迫包含干旱胁迫、盐胁迫、aba胁迫、meja胁迫、peg胁迫、低温胁迫、热胁迫中的至少一种；进一步包含干旱胁迫、盐胁迫中的至少一种；更进一步包含干旱胁迫和盐胁迫。

59、本发明的第五个方面，提供一种试剂，包含：l1)～l3)中至少一种；l1)本发明第二个方面的sgrna；l2)本发明第三个方面的生物材料；l3)本发明第四个方面的crispr/cas系统。

60、优选地，所述试剂用于i1)～i4)中至少一种：i1)降低植物的非生物胁迫抗性；i2)降低植物的株高；i3)提高植物的分蘖数；i4)培育植物品种；

61、所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性降低；(2)株高降低；(3)分蘖数提高。

62、优选地，所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性相对于参考水平降低；(2)株高相对于参考水平降低；(3)分蘖数相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

63、优选地，所述植物包含禾本科植物；进一步包含水稻。

64、优选地，所述非生物胁迫包含干旱胁迫、盐胁迫、aba胁迫、meja胁迫、peg胁迫、低温胁迫、热胁迫中的至少一种；进一步包含干旱胁迫、盐胁迫中的至少一种；更进一步包含干旱胁迫和盐胁迫。

65、本发明的第六个方面，提供一种方法，包含：降低植物中osrfs蛋白的表达量和/或活性的步骤；

66、所述方法为m1)～m4)中至少一种：m1)降低植物的非生物胁迫抗性的方法；m2)降低植物的株高的方法；m3)提高植物的分蘖数的方法；m4)培育植物品种的方法；

67、所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性降低；(2)株高降低；(3)分蘖数提高。

68、优选地，所述植物品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)非生物胁迫抗性相对于参考水平降低；(2)株高相对于参考水平降低；(3)分蘖数相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

69、优选地，所述降低植物中osrfs蛋白的表达量和/或活性的步骤是将n1)～n4)中至少一种导入植物组织内和/或植物细胞内；

70、n1)本发明第二个方面的sgrna；n2)本发明第三个方面的生物材料；n3)本发明第四个方面的crispr/cas系统；n4)本发明第五个方面的试剂。

71、优选地，所述导入的方式包含通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接的dna转化，显微注射、电穿孔等各种常规或特异的遗传转化方法。

72、本发明的第六个方面，提供另一种方法，包含：提高植物中osrfs蛋白的表达量和/或活性的步骤；

73、所述方法为o1)～o3)中至少一种：o1)提高植物的非生物胁迫抗性的方法；o2)降低植物的株高的方法；o3)培育植物品种的方法；

74、所述植物品种包含(4)～(5)中至少一种特征：(4)非生物胁迫抗性提高；(5)株高降低。

75、优选地，所述植物品种包含(4)～(5)中至少一种特征：(4)非生物胁迫抗性相对于参考水平提高；(5)株高相对于参考水平降低。

76、优选地，所述提高植物中osrfs蛋白的表达量和/或活性的步骤是将编码osrfs蛋白的核酸分子导入植物组织或植物细胞中。

77、优选地，所述编码osrfs蛋白的核酸分子通过重组载体导入植物组织或植物细胞中；所述重组载体为将所述编码osrfs蛋白的核酸分子插入表达载体的多克隆位点后得到的载体。

78、优选地，所述表达载体包含pbi121系列载体、pcambia系列载体、pylox.5中的至少一种；进一步包含pylox.5。

79、优选地，所述重组载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它效应mrna加工或基因表达的dna片段。

80、优选地，所述重组载体还包含任何一种强启动子或诱导型启动子。

81、优选地，所述强启动子或诱导型启动子包括但不限于泛素(ubiqutin)启动子和花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子，它可单独使用或与其他的植物启动子结合使用。

82、优选地，所述重组载体还包含增强子。

83、优选地，所述增强子的区域包括但不限于atg起始密码子和邻接区域。起始密码子必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或来自结构基因。

84、优选地，所述重组载体还包含可选择性标记。

85、优选地，所述可使用的选择性标记包括编码抗除草剂的酶的基因或具有抗性的抗生素标记物；所述的除草剂包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等。从转基因植物的安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

86、优选地，所述导入的方式包含通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接的dna转化，显微注射、电穿孔等各种常规或特异的遗传转化方法。

87、优选地，所述方法包括如下步骤：1)将表达osrfs蛋白的重组载体导入农杆菌，得到表达osrfs蛋白的重组载体的阳性菌落；2)将表达osrfs蛋白的重组载体的阳性菌侵染植物组织，得到转基因植物。

88、优选地，所述农杆菌包含根癌农杆菌。

89、优选地，所述植物包含禾本科植物；进一步包含水稻。

90、优选地，所述非生物胁迫包含干旱胁迫、盐胁迫、aba胁迫、meja胁迫、peg胁迫、低温胁迫、热胁迫中的至少一种；进一步包含干旱胁迫、盐胁迫中的至少一种；更进一步包含干旱胁迫和盐胁迫。

91、优选地，所述osrfs蛋白为c1)～c3)中任一种；c1)氨基酸序列如seq id no.16所示的osrfs蛋白；c2)将seq id no.16经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.16具有相同功能的osrfs蛋白；c3)与seq id no.16具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与seq id no.16具有相同功能的osrfs蛋白。

92、优选地，所述编码osrfs蛋白的核酸分子的序列为h1)～h6)中任一种：h1)如seqid no.3所示；h2)将seq id no.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.3具有相同功能的核甘酸序列；h3)与seq id no.3具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与seq idno.3具有相同功能的核苷酸序列；h4)如seqid no.4所示；h5)将seq id no.4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.4具有相同功能的核甘酸序列；h6)与seq id no.4具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与seq id no.4具有相同功能的核苷酸序列。

93、本发明的有益效果是：

94、本发明首次公开了aba、meja、脱水、peg、盐、低温和热都能影响植物osrfs基因的表达，并公开了osrfs蛋白在调控植物的非生物胁迫抗性、调控植物的株高、调控植物的分蘖数中的应用，降低osrfs蛋白表达量和/或其活性可以降低植物的株高、提高植物的分蘖数，提高osrfs蛋白表达量和/或其活性可以提高非生物胁迫抗性、降低植物的株高，从而培育相关植物品种。