温敏性水凝胶、基于其的伤口敷料及其制备方法和用途与流程

本发明属于生物医学，具体涉及一种温敏性水凝胶、负载外泌体的温敏性水凝胶、伤口敷料及其制备方法和用途。

背景技术：

1、糖尿病是一种发病率较高的内分泌代谢疾病，创伤是糖尿病患者最主要并发症之一。一方面，糖尿病创伤组织中血管基膜的改变、胶原蛋白表达下调、免疫反应紊乱阻碍了伤口愈合；另一方面，糖尿病人的创伤容易受到细菌和真菌的感染；因此，迫切需要探索一种新的治疗糖尿病创伤愈合的方法。

2、水凝胶是一种三维亲水聚合网络，水凝胶作为一种伤口敷料，具有吸水保湿的功能，能够避免伤口的细菌和真菌感染。传统的水凝胶敷料多为固态，与伤口的黏附性并不强，并且其对糖尿病创伤愈合只是起到辅助作用，糖尿病创面的愈合主要依赖于患者自身的免疫力。

3、伯洛沙姆407是一种合成的高分子材料，其生物相容性好，能够形成温敏性水凝胶。然而，泊洛沙姆水凝胶易溶解且力学性能差，若用其负载外泌体等治疗性成分，则外泌体等治疗性成分将得不到缓释。

4、外泌体是细胞分泌的、直径在30至150nm之间的小囊泡。作为最重要的细胞分泌物之一，外泌体中包含复杂的rna、蛋白质和内源性因子。研究表明，外泌体可以显著加速细胞增殖、迁移和血管生成以及伤口区域周围的胶原蛋白沉积。然而，外泌体直接注射容易被人体的免疫系统清除，从而导致利用率较低。因此，迫切需要开发一种能够负载外泌体、使其在体内不被免疫系统清除并能够在体内缓慢释放的载体。

5、壳聚糖是是甲壳质经脱乙酰反应后的产品，具有生物可降解性、生物功能性、抗菌性和抗炎性无毒性，但其溶解性较差。因此，为了让壳聚糖在生物材料中能够良好的应用，经常对壳聚糖进行化学改性，其中分子修饰是最重要的一种化学改性手段。羟丙基壳聚糖是壳聚糖的衍生物之一，是在壳聚糖上引入羟丙基基团而获得的一种改性大分子。羟丙基壳聚糖不仅保留了壳聚糖的优点，而且还具有较好的水溶性和优异的力学功能。

6、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、发明目的

2、针对现有技术中的上述缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种能够负载外泌体使其在体内不被免疫系统清除并能够在体内缓慢释放的、孔径适中且均一、具有优异粘度的温敏性水凝胶，基于其的外泌体水凝胶、伤口敷料，以及其制备方法和应用。

3、解决方案

4、为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：

5、第一方面，本发明提供了一种温敏性水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

6、1)将泊洛沙姆溶解在磷酸盐缓冲液或生理盐水中，制备溶液i；

7、2)向溶液i中加入羟丙基壳聚糖，混合均匀，然后，任选地加入β-甘油磷酸纳，混合均匀，得到所述温敏性水凝胶。

8、上述制备方法中，作为优选，步骤1)中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆407；

9、和/或，所述磷酸盐缓冲液为pbs缓冲液；

10、和/或，所制备的溶液i中，泊洛沙姆的质量体积百分浓度为20％-40％、优选20％-30％、更优选25％。

11、作为优选，步骤2)中，羟丙基壳聚糖的加入浓度按质量体积百分比计为2％-5％、优选2％-3％；和/或，β-甘油磷酸纳的加入浓度按质量体积百分比计为0％-4％、优选1％-3％、最优选2％。

12、上述制备方法中，所述羟丙基壳聚糖可商购获得，也可通过本领域的常规制备方法制得；例如，所述羟丙基壳聚糖可通过以下方法制得：

13、称取适量的壳聚糖，将其加入定量的1m氢氧化钠溶液中，在室温下搅拌均匀，并在4℃下过夜，以使其充分溶胀，制备成碱性壳聚糖溶液；然后，通过过滤、干燥，得到碱性壳聚糖；向碱性壳聚糖中加入适量的异丙醇，室温搅拌下使其完全溶解，缓慢加入过量的1,3-环氧丙烷，搅拌反应一定时间后，真空旋转蒸发溶剂，得到羟丙基壳聚糖。具体合成路线如下：

14、

15、第二方面，本发明提供了一种温敏性水凝胶，所述温敏性水凝胶由泊洛沙姆、羟丙基壳聚糖在或不在β-甘油磷酸钠的存在下交联形成；

16、优选地，所述温敏性水凝胶通过如上述第一方面所述的制备方法制得。

17、第三方面，本发明提供了一种负载外泌体的温敏性水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

18、i)采用如上述第一方面所述的制备方法，制得温敏性水凝胶；

19、ii)制备间充质干细胞外泌体的pbs或生理盐水重悬液；

20、iii)将步骤ii)获得的间充质干细胞外泌体的pbs或生理盐水重悬液加入步骤i)所制得的温敏性水凝胶中，混合均匀，得到所述负载外泌体的温敏性水凝胶。

21、上述负载外泌体的温敏性水凝胶的制备方法中，作为优选，步骤ii)中，所述间充质干细胞外泌体为脂肪间充质干细胞外泌体；优选地，所述脂肪间充质干细胞外泌体的pbs或生理盐水重悬液通过下述方法制得：

22、将脂肪间充质干细胞培养物离心，取其上清，称为上清液i；然后，将上清液i离心，以去除细胞碎片，取其上清，称为上清液ii；再将上清液ii离心，以去除微囊泡，取其上清，称为上清液iii；最后，将上清液iii在80000～120000g、优选100000g下离心60～100min、优选离心80min，弃掉上清液，将所得沉淀用pbs或生理盐水重悬，得到脂肪间充质干细胞外泌体的pbs或生理盐水重悬液；任选地，使所得脂肪间充质干细胞外泌体的pbs或生理盐水重悬液通过过滤器、优选0.22μm的过滤器，以进行灭菌；

23、作为优选，步骤ii)中，所述间充质干细胞外泌体在其pbs或生理盐水重悬液中的浓度为100～1000μg/ml、优选300～800μg/ml、最优选500μg/ml；例如，所述间充质干细胞外泌体在其pbs或生理盐水重悬液中的浓度可以为100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μg/ml。

24、作为优选，步骤iii)中，所述间充质干细胞外泌体的pbs或生理盐水重悬液与所述温敏性水凝胶的体积比为1:80～1:120，优选为1:100。

25、作为优选，步骤iii)在2～6℃、优选4℃下进行。

26、第四方面，本发明提供了一种负载外泌体的温敏性水凝胶，其通过如上述第三方面所述的制备方法制得。

27、第五方面，本发明提供了一种伤口敷料，所述伤口敷料包含如上述第二方面所述的温敏性水凝胶和/或如上述第四方面所述的负载外泌体的温敏性水凝胶。

28、第六方面，本发明提供了如上述第二方面所述的温敏性水凝胶和/或如上述第四方面所述的负载外泌体的温敏性水凝胶在制备用于创伤愈合的伤口敷料中的应用；

29、在优选的实施方案中，所述创伤为糖尿病创伤。

30、有益效果

31、1、与现有的温敏性水凝胶相比，本发明的温敏性水凝胶具有均匀且适中的孔径，能够使外泌体均一地负载在水凝胶上，可以显著延缓外泌体在体内的释放，从而加强外泌体的治疗效应。

32、2、本发明的负载外泌体的温敏性水凝胶或伤口敷料可在创面(特别是糖尿病患者创面)原位成胶，并且其粘附性较好，液态下可渗透伤口内部，更加贴合伤口，有利于伤口愈合。

33、3、与现有伤口敷料相比，本发明的外泌体水凝胶或伤口敷料与伤口紧密结合，能够稳定、缓慢释放外泌体，外泌体中的蛋白质、生长因子、microrna等可促进例如糖尿病患者伤口中内皮细胞和成纤维细胞的增殖和迁移，从而促进伤口的愈合。

34、4、此外，本发明的水凝胶中引入了羟丙基壳聚糖，而羟丙基壳聚糖本身即具有抗菌消炎作用，因此，与现有的伤口敷料相比，本发明的水凝胶或伤口敷料的抗菌消炎作用更强，并且，本发明的水凝胶的ph值为中性，对伤口没有刺激性；这些因素加一起，更加有利于人体伤口的愈合。