一种猪禽替抗添加剂及其筛选方法

本发明涉及饲料添加剂，具体涉及一种猪禽替抗添加剂及其筛选方法。

背景技术：

1、自1949年stokad等发现饲喂金霉素对家禽生长具有促进作用以来，抗生素在养殖业中预防动物疾病、促进动物生长及提高养殖业产量起到了积极的作用。但是，近年来，抗生素的滥用导致的各种危害，如不良反应、过敏反应、变态反应、细菌耐药、菌群失调，“三致”作用等已成为一个世界性难题。1986年瑞典全面禁止抗生素促生长剂在动物饲料中应用，一些发达国家也对此相继颁布法规和措施。因此，发展多功能、多类别且无毒、无残留、无副作用的绿色替抗生素饲料替抗添加剂(简称替抗添加剂)成为现代健康养殖和社会发展的必然需求。

2、现有的替抗添加剂筛选方法主要为饲养实验。然而，添加剂种类众多，采用饲养实验法筛选添加剂的周期长，以肉鸡为例一般饲养21天以上。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪禽替抗添加剂及其筛选方法，本发明提供的筛选方法获得合格猪禽替抗添加剂的周期短且成本低。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种猪禽替抗添加剂的筛选方法，包括以下步骤：

4、(1)将待选猪禽替抗添加剂、胃蛋白酶溶液和饲料混合，进行第一孵育，得到孵育样品液；

5、(2)将胃蛋白酶溶液和饲料混合，进行第二孵育，得到孵育对照液；

6、(3)分别将所述孵育样品液和所述孵育对照液与动物十二指肠肠液混合，进行第三孵育，分别得到消化反应样品肠液和消化反应对照肠液；

7、(4)测试所述消化反应样品肠液和消化反应对照肠液的消化率，分别得到样品消化率和对照消化率，当所述样品消化率与对照消化率的显著性p<0.05时，所述待选猪禽替抗添加剂为目标猪禽替抗添加剂；所述消化率包括干物质消化率和/有机物消化率；

8、步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。

9、优选地，所述步骤(3)后还包括：

10、(5)分别将所述消化反应样品肠液和消化反应对照肠液接种于含革兰氏杆菌的培养基中，进行培养，分别得到样品菌落数和对照菌落数，当所述样品菌落数与对照菌落数的显著性p<0.05时，所述待选猪禽替抗添加剂为目标猪禽替抗添加剂；所述革兰氏杆菌包括革兰氏阳性杆菌和/或革兰氏阴性杆菌；

11、步骤(4)和步骤(5)没有时间先后顺序。

12、优选地，所述步骤(3)后还包括：

13、(6)分别测试所述消化反应样品肠液和消化反应对照肠液的自由基清除率，分别得到样品自由基清除率和对照自由基清除率，当所述样品自由基清除率与对照自由基清除率的显著性p<0.05时，所述待选猪禽替抗添加剂为目标猪禽替抗添加剂；所述自由基包括1,1-二苯基-2-苦基肼自由基、4-苄酰氧基-四甲基哌啶氧自由基、16-doxyl-硬脂酸自由基和氮氧自由基哌啶醇中的一种或几种；

14、步骤(4)和步骤(6)没有时间先后顺序；

15、步骤(5)和步骤(6)没有时间先后顺序。

16、优选地，所述待选猪禽替抗添加剂的种类包括丁酸钠、胍基乙酸、甘露寡糖、果寡糖、葡萄糖氧化酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶和枯草芽孢杆菌中的至少一种；以饲料为基准，所述丁酸钠的添加量为0.1～3g/kg；所述胍基乙酸的添加量为0.3～2g/kg；所述甘露寡糖的添加量为0.3～4.0g/kg；所述果寡糖添加量为1～16g/kg；所述葡萄糖氧化酶的添加量为200～2000u/kg；所述甘露聚糖酶的添加量为2000～25000u/kg；所述植酸酶的添加量为200～20000u/kg；所述木聚糖酶的添加量为500～3000u/kg；所述枯草芽孢杆菌添加量为5×106～5×1014cfu/kg。

17、优选地，所述动物十二指肠肠液在使用前依次进行生理盐水稀释和离心分离。

18、优选地，所述胃蛋白酶溶液的酶活力与饲料的质量之比为2.0×107～3.0×107u：1kg。

19、优选地，所述第一孵育、第二孵育和第三孵育的温度独立地为20～50℃，时间独立地为1～8h。

20、优选地，所述培养的温度为20～50℃，时间为1～8h。

21、本发明提供了上述技术方案所述筛选方法得到的猪禽替抗添加剂，包括丁酸钠、甘露寡糖、果寡糖、甘露聚糖酶、植酸酶和枯草芽孢杆菌中的至少两种；以饲料为基准，所述甘露寡糖添加量为1.0～3.0g/kg，所述果寡糖的添加量为5～12g/kg，所述甘露聚糖酶添加量为6000～18000u/kg，所述植酸酶添加量为800～15000u/kg，所述枯草芽孢杆菌添加量为5×109～5×1011cfu/kg。

22、优选地，包括甘露寡糖-果寡糖-枯草芽孢杆菌复配猪禽替抗添加剂、甘露寡糖-甘露聚糖酶-枯草芽孢杆菌复配猪禽替抗添加剂、甘露寡糖-甘露聚糖酶-丁酸钠复配猪禽替抗添加剂、甘露寡糖-果寡糖-甘露聚糖酶复配猪禽替抗添加剂、甘露寡糖-果寡糖-丁酸钠复配猪禽替抗添加剂或甘露寡糖-枯草芽孢杆菌-植酸酶复配猪禽替抗添加剂。

23、本发明提供了一种猪禽替抗添加剂的筛选方法，包括以下步骤：(1)将待选猪禽替抗添加剂、胃蛋白酶溶液和饲料混合，进行第一孵育，得到孵育样品液；(2)将胃蛋白酶溶液和饲料混合，进行第二孵育，得到孵育对照液；(3)分别将所述孵育样品液和所述孵育对照液与动物十二指肠肠液混合，进行第三孵育，分别得到消化反应样品肠液和消化反应对照肠液；(4)测试所述消化反应样品肠液和消化反应对照肠液的消化率，分别得到样品消化率和对照消化率，当所述样品消化率与对照消化率的显著性p<0.05时，所述待选猪禽替抗添加剂为目标猪禽替抗添加剂；所述消化率包括干物质消化率和/或有机物消化率；步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。传统的饲养实验法筛选猪禽替抗添加剂，需要将不同添加量的单一添加剂、不同种类及不同添加量的复配添加剂分别混到饲料中，以含有添加剂的饲料喂养动物，以鸡为例一般饲养21天或42天，然后测试其生长性能以确定添加剂对动物生长性能(如平均日增重、料重比、死淘率)的影响。而本发明采用体外消化实验对猪禽替抗添加剂进行筛选，无需进行饲养实验即可快速实现单一猪禽替抗添加剂的添加量、复配猪禽替抗添加剂的种类及其添加量的确定，猪禽替抗添加剂的筛选周期短、效率高且成本低显著性p<0.05，说明添加了猪禽替抗添加剂后能够明显提高了饲料的消化率。而且，采用本发明提供的筛选方法得到的猪禽替抗添加剂胃肠液耐受性好，提高动物的回肠干物质及有机物消化率，温度耐受性好，储存时间长，动物日增重比例高，饲料料重比低，能够提高饲料利用率，很好的代替饲料抗生素。

24、进一步的，本发明提供的筛选方法还包括测试消化反应样品肠液和消化反应对照肠液对革兰氏阳性杆菌和革兰氏阴性杆菌的数量的影响，能够筛选得到促进回肠双歧杆菌的增殖、抑制了回肠沙门氏菌的增殖的猪禽替抗添加剂，改善肠道菌群结构，促进有益菌的增殖，抑制有害菌的增殖，从而提高消化率和动物机体健康。

25、进一步的，本发明提供的筛选方法还包括测试消化反应样品肠液和消化反应对照肠液的自由基清除率，能够筛选得到提高回肠抗氧化能力的猪禽替抗添加剂，从而改善肠道内环境。

26、本发明还提供了上述技术方案所述筛选方法得到的猪禽替抗添加剂，包括丁酸钠、甘露寡糖、果寡糖、甘露聚糖酶、植酸酶和枯草芽孢杆菌中的至少两种；以饲料为基准，所述甘露寡糖添加量为1.0～3.0g/kg，所述果寡糖的添加量为5～12g/kg，所述甘露聚糖酶添加量为6000～18000u/kg，所述植酸酶添加量为800～15000u/kg，所述枯草芽孢杆菌添加量为5×109～5×1011cfu/kg。丁酸钠中的丁酸能够为肠道细胞提供能量，提高动物肠道的消化吸收能力、杀菌抗菌增强免疫力，丁酸钠的特殊气味还可以作为诱食剂，提高动物的采食量。甘露寡糖可将半纤维素降解为甘露低聚糖供动物利用，显著提高了动物的饲料利用率、生长性能和免疫力；果寡糖通过调节动物肠道中微生物区系平衡而实现的，具体的，动物体内分泌的α-淀粉酶、蔗寡酶、麦芽糖酶不能水解以β-1,2-糖苷键相连的果寡糖，因此果寡糖大都能顺利通过胃和小肠而不被降解利用，但大肠中的乳酸杆菌、双岐杆菌和梭状芽孢杆菌可产生一系列果糖苷酶，使这些有益菌得到养分而增殖，而有害菌不能分泌果糖苷酶，同时有益菌增殖后，会抑制有害菌，从而使肠道微生态系统调整到正常状态。甘露聚糖酶能够促进甘露聚糖分解产生的甘露寡糖，可被动物肠道中的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌、沙门氏菌的感染，还能够减少肉鸡球虫病的危害，提高肉鸡均匀度。甘露聚糖酶为一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子igf-i的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长。植酸酶可以促进动物对于钙磷的吸收。枯草芽孢杆菌可以消耗氧气使得肠道内保持低氧，枯草芽孢杆菌菌体产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；枯草芽孢杆菌自身可以分泌消化酶提高肠道的消化能力；枯草芽孢杆菌对特殊菌体进行促芽孢和微胶囊包被处理，在芽孢状态下稳定性好，能耐氧化、耐挤压、耐高温(能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20min)、耐酸碱(在酸性胃环境中能保持活性)，可以耐唾液和胆汁的攻击，是微生物中可100％直达大小肠的活菌。本发明筛选得到的猪禽替抗添加剂对胃肠液耐受性好，温度耐受性好，储存时间长，提高动物回肠干物质及有机物消化率，促进回肠双歧杆菌的增殖，抑制回肠沙门氏菌的增殖，提高回肠抗氧化能力，提高动物日增重，降低饲料料重比，提高饲料利用率，能够很好的代替饲料抗生素。