与小麦籽粒硬度相关的KASP标记及其应用

本发明涉及作物分子遗传育种，具体涉及与小麦籽粒硬度相关的kasp标记及其应用。

背景技术：

1、小麦是我国第二大粮食作物，也是酿造白酒的重要原料。目前酿酒专用小麦种质资源匮乏，影响优质品种的发展，同时酿酒小麦品质受品种和环境因素影响大，选育品种中具广谱抗病性的品种很稀少。因此要加强酿酒(弱筋)小麦种质资源的收集鉴定和筛选，筛选筋力弱、硬度低、抗逆性好的种质资源。

2、酿酒专用小麦分为制曲专用小麦、酿酒发酵专用小麦。小麦既是制曲原料(小麦占95％-100％)，也是酿酒发酵的主要原料之一。小麦籽粒硬度与酿酒的品质息息相关。在制曲过程中，因硬麦较脆，多被粉碎成颗粒，无法达到制曲原料的粉碎要求，制成的曲块紧，发酵过程中水分不易蒸发，曲心易霉变，硬麦的晶状淀粉不易被微生物利用，曲中微生物种类和数量少，影响大曲质量，而软麦易压成片状，制成的曲块松紧适宜，曲中微生物易繁衍，有利于大曲的发酵生香，保障大曲的质量。大曲是白酒的发酵生香剂，大曲的品质奠定了白酒品质的基础。在酿酒发酵过程中，硬麦中蛋白质含量高，在制曲过程中只能被分解一部分，在酿酒发酵过程中蛋白质则转变为杂醇油，影响酒质，而软麦中一般支链淀粉含量高，易于糊化，出酒率高，产量稳定。因此小麦原料品质的好坏在一定程度上决定酿酒的品质，以泸州老窖为例，泸州老窖大曲的制曲原料90％以上都是小麦，传统制曲要求是小麦“心烂皮不烂”，对小麦的软质率要求较高。

3、小麦的籽粒硬度为数量性状不仅受多对基因控制，还受包括土壤含水量、肥力等气候因素的影响。研究发现，小麦籽粒硬度主要是由位于5d短臂上的两个主效基因pina(puroindoline a)和pinb(puroindoline b)调控，pina和pinb紧密连锁，共同形成小麦籽粒硬度的分子遗传基础，pina和pinb基因突变或缺失均会引起小麦胚乳质地的硬度增加。通过小麦pan genome数据，分析pin基因遗传变异情况，根据差异位点开发相应的分子标记，用于小麦硬度的精准设计，对优质软质酿酒专用小麦品种的选育均具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供与小麦籽粒硬度相关的kasp标记及其应用，通过小麦pangenome数据，分析pin基因遗传变异情况，在pinb基因找出了不同等位基因类型，根据差异位点进行了kasp标记开发，能够快速鉴定小麦籽粒的硬度，辅助软质酿酒专用小麦品种的选育工作，缩短育种年限。

2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

3、本发明的第一目的是，提供一种检测小麦籽粒硬度的物质，所述物质为用于检测小麦基因组中染色体5d上3609894bp处的分子标记pinb_3609894的脱氧核糖核苷酸是gg、aa或ga的成套引物或含有所述成套引物的检测试剂或试剂盒；

4、本发明的第一目的是，提供小麦基因组中染色体5d上3609794-3609994bp处分子标记的序列，序列如seq id no.4所示；

5、序列中[g/a]为snp位点的位置。

6、进一步的，所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物。上游引物根据所述小麦基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的基因片段的第101位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为c，另一条上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为t，本引物利用的反向互补设计的原则；下游引物根据所述小麦基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的基因片段的第101位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

7、进一步的，所述成套引物pinb_3609894-f为由seq id no.4序列的第101-119位所示的单链dna分子或其衍生物、pinb_3609894-h为由seq id no.4序列的第101-119位所示的单链dna分子或其衍生物和pinb_3609894-g为由seq id no.4序列所示的第101-119位单链dna分子组成的成套引物。

8、进一步的，所述pinb_3609894-f的第101-119位所示的单链dna分子的衍生物的单链dna分子的5'端连接特异荧光标签序列a；所述pinb_3609894-h的第101-119位所示的单链dna分子的衍生物的单链dna分子的5'端连接特异荧光标签序列b。

9、进一步的，所述特异荧光标签序列a为荧光标签序列fam，所述特异荧光标签序列b为荧光标签序列hex。

10、进一步的，所述上游引物的序列分别如pinb_3609894-f、pinb_3609894-h所示，所述下游引物的序列如pinb_3609894-g所示。

11、本发明的另一目的在于，提供了上述的物质/引物序列组在如下任一中的应用：

12、(a)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒硬度性状；

13、(b)比较待测小麦籽粒硬度的高低；

14、(c)选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

15、(d)选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；

16、(e)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦籽粒硬度高低的产品；

17、(f)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

18、(g)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

19、本发明另一目的在于，提供了如下任一方法：

20、方法a：

21、一种比较待测小麦籽粒硬度的方法，包括如下步骤(a1)或(a2)：

22、(a1)检测小麦基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是gg还是aa还是g和a；

23、(a2)按照如下确定所述待测小麦籽粒硬度：基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是g的纯合体则所述待测小麦籽粒硬度低于于基因组中染色体5d上，上述序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是a的纯合体或者是g和a的杂合体的所述待测小麦的籽粒硬度；

24、方法b：

25、一种选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

26、(b1)检测小麦基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是gg还是aa还是g和a；

27、(b2)选择基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是a的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是a的纯合体的小麦，最终获得籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

28、方法c：

29、一种选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

30、(c1)检测小麦基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是cc还是tt还是c和t；

31、(c2)选择基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是g的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是g的纯合体的小麦，最终获得籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。

32、进一步的，所述(a1)、(b1)、(c1)的具体操作为，采用本发明上述的检测试剂或试剂盒对待测小麦基因组dna进行pcr扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是gg还是aa还是g和a：

33、若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是g的纯合体；

34、若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为黄色，则所述待测小麦基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是a的纯合体；

35、若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为绿色，则所述待测小麦基因组中染色体5d上，seq id no.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是c和t的杂合体。

36、进一步的，所述pcr扩增具体为，引物组组合中以摩尔比计，所述上游引物f：所述上游引物h：所述下游引物＝12：12：30；pcr反应程序为：94℃、15min；94℃、15s，65℃、1min，10个循环(每个循环减低1℃)；94℃、20s，57℃、1min，40个循环；12℃、15min。

37、10μl扩增体系可参考设计如下：

38、所述primer mix，每100μl中：

39、上游引物f(f1)，10um、12μl；

40、上游引物h(f2)，10um、12μl；

41、下游引物(r)，10um、30μl；

42、ddh2o，46μl。

43、本发明的有益效果：

44、本发明相对于现有技术而言，筛选鉴定到一个影响小麦籽粒硬度的位点，经检测该位点与小麦籽粒硬度性状显著相关。初步研究结果表明，aa基因型具有低硬度表型优势。基于该位点，结合kasp技术原理，本发明进一步开发了鉴定该位点的特异性引物组合，采用本发明的特异性引物组合可以检测待测小麦的籽粒硬度性状，并进行高硬度性状或低硬度性状的小麦品种的筛选和选育，从而可为小麦籽粒硬度性状鉴定和软质小麦新品种培育奠定一定理论基础和技术基础。

45、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。