抗菌肽Ple-AB及其制备方法和应用

本发明涉及抗菌肽，尤其涉及抗菌肽ple-ab及其制备方法和应用。

背景技术：

1、传统抗生素耐药性的增加促进了抗菌肽(antimicrobial peptides,amps)的发展与应用，amps广泛存在于动物、植物和微生物中，是宿主先天免疫系统的重要组成成分之一，对微生物、寄生虫甚至是肿瘤具有抑制作用(liu y,shi j,tong z,jia y,yang b,wangz.the revitalization of antimicrobial peptides in the resistanceera.pharmacol res.2021(07)；163:105276.)。amps多靶点的作用机制使其不易产生耐药性，但是天然抗菌肽存在对宿主细胞毒性，表达量低和蛋白酶敏感等缺陷，一些抗菌肽还表现出杀菌活性不足，因此如何提高抗菌肽的产量、活性和最大程度降低其毒性成为目前抗菌肽药物开发的难点所在(jiang y,chen y,song z,tan z,cheng j.recent advances indesign of antimicrobial peptides and polypeptides toward clinicaltranslation.adv drug deliv rev.2021(03)；170:261-280.)。对天然抗菌肽进行有目的的改造以克服其存在的上述问题对于抗菌肽药物的开发具有重要意义。

2、plectasin是从腐生子囊菌中分离得到的首例真菌防御素，是一个由40个氨基酸残基组成的多肽，属于半胱氨酸稳定的α-螺旋和β-折叠超家族，对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌活性(mygind ph,fischer rl,schnorr km,hansen mt,cp,ludvigsen s,etal.plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from asaprophytic fungus.nature.2005；437(7061):975-80.)。但是，plectasin存在稳定性差、细胞毒性强的缺陷(li z,wang x,wang x,et al.research advances on plectasin andits derivatives as new potential antimicrobial candidates.processbiochemistry.2017；62-70.)，并且plectasin在发酵过程中表达量较低，使得其生产成本提高，造成其在临床应用中受到制约。

技术实现思路

1、本发明提供抗菌肽ple-ab及其制备方法和应用。

2、本发明对真菌防御素plectasin进行设计改造，经不断筛选，通过氨基酸截短组合改造得到了plectasin的衍生肽ple-ab，其氨基酸序列如seq id no.1所示，该多肽相较于plectasin的抗菌活性明显提高，且具有更高的稳定性和表达量。

3、具体地，本发明提供以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为以下(1)～(3)任一种：

5、(1)如seq id no.1所示的氨基酸序列；

6、(2)在如seq id no.1所示的氨基酸序列的n端和/或c端连接选自蛋白标签、酶切位点、连接肽中的一种或多种后得到的序列；

7、(3)将seq id no.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的氨基酸序列。

8、seq id no.1所示的氨基酸序列如下：gfgcpwdemqchnhcksikgykggycakggfvckcy。

9、上述(2)中，在seq id no.1所示序列的n端和/或c端添加蛋白标签、酶切位点、连接肽通常不会影响序列如seq id no.1所示的蛋白的结构和功能。因此，具有(2)中所示序列的多肽也在本发明的保护范围内。

10、在具有上述氨基酸序列的基础上，本领域技术人员可在多肽的c端和/或n端共价或非共价地连接修饰基团，所述修饰基团包括乙酰基、酰胺基、醛基、甲基、酯基、烷基等，由此得到的多肽也在本发明的保护范围内。

11、第二方面，本发明提供编码以上所述的多肽的核酸分子。

12、根据以上所述的多肽的氨基酸序列，本领域技术人员可以获得编码所述多肽的核酸分子的核苷酸序列。基于密码子的简并性，上述核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码上述多肽的核酸分子均在本发明的保护范围内。

13、优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。序列如seq id no.2所示的核酸分子能够在毕赤酵母中进行高效表达，提高多肽的表达量。

14、第三方面，本发明提供包含以上所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

15、以上所述的表达盒可由启动子、终止子、终止密码子和/或酶切位点与编码所述多肽的核酸分子连接得到，表达盒中还可包含其他转录、翻译调控元件。

16、在本发明的一些实施方式中，在所述核酸分子的5’端添加xhoi酶切位点和kex2切割位点，3’端添加taa和tag终止密码子序列以及noti酶切位点，得到所述表达盒，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

17、以上所述的载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子等，其中质粒载体包括复制型载体和非复制型载体。

18、在本发明的一些实施方式中，将所述核酸分子或其表达盒与载体ppiczαa连接，得到的重组酵母表达载体。

19、以上所述的宿主细胞包括微生物细胞或动物细胞，其中微生物包括细菌(例如：大肠杆菌)或真菌(例如：毕赤酵母)。

20、第四方面，本发明提供一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母表达以上所述的多肽，或含有以上所述的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒或载体。

21、在本发明的一些实施方式中，将含有所述核酸分子的表达载体线性化后转化毕赤酵母x-33，得到重组毕赤酵母。

22、第五方面，本发明提供以上所述多肽的制备方法，所述方法包括：以毕赤酵母作为宿主细胞，表达所述多肽。

23、具体地，所述方法包括：对所述重组毕赤酵母进行发酵培养，分泌产生所述多肽。

24、第六方面，本发明提供以上所述的多肽或所述核酸分子或所述生物材料在制备抑菌产品中的应用。

25、优选地，所述抑菌产品为保鲜剂、杀菌剂、消毒剂、防腐剂、饲料添加剂、食品添加剂或药物。

26、优选地，本发明所述的抑菌所针对的细菌为革兰氏阳性菌。所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)等。

27、第七方面，本发明提供以上所述的多肽或所述核酸分子或所述生物材料在食品保鲜、化妆品抑菌防腐或环境消毒中的应用。

28、第八方面，本发明提供一种药物，所述药物包含以上所述的多肽。

29、第九方面，本发明提供一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含以上所述的多肽。

30、第十方面，本发明提供一种杀菌剂或防腐剂，所述杀菌剂或防腐剂包含以上所述的多肽。

31、本发明的有益效果在于：本发明以真菌防御素plectasin为模板，经设计改造得到抗菌肽ple-ab，该抗菌肽与plectasin相比，具有明显更高的抗菌活性，对革兰氏阳性菌具有较好的杀菌效果；具有更高的稳定性，尤其表现出优异的耐胰蛋白酶特性；同时，其发酵表达量也明显提高。而且，该抗菌肽对小鼠红细胞的溶血活性以及对鼠源巨噬细胞的细胞毒性很低，具有低毒性的优势。

32、本发明通过优化抗菌肽ple-ab的基因序列，构建特异的表达载体，实现了抗菌肽ple-ab在毕赤酵母中的高效表达，并建立了完善的纯化体系，可实现抗菌肽ple-ab的规模化生产，可开发用于抗菌药物、添加剂、化妆品、保健品等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。