一种生产核苷及其相关衍生物的方法、突变体、重组微生物与应用与流程

本发明涉及微生物工程，具体地说，涉及一种生产核苷及其相关衍生物的方法、突变体、重组微生物与应用。

背景技术：

1、核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由d-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与rna组成，由d-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与dna组成。d-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(a)、鸟苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。

2、鸟嘌呤核苷(鸟苷)和次黄嘌呤核苷(肌苷)在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(amp)和鸟苷酸(gmp)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。

3、腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷除了可以用作治疗心脏的特效药物之外，还是用于合成三磷酸腺苷(atp)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，广泛应用于医药等行业。

4、目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差、核苷的产量仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种能够高效率生产嘌呤核苷的方法、突变体及含有其的微生物和应用。

2、本发明研究发现，经过特定修饰枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的海藻糖-6-磷酸水解酶(由trea基因编码)，可使得含有其的微生物能高效、高速生成腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷酸或次黄嘌呤核苷。目前尚无专利或文献报道有关修饰trea基因可提高微生物产核苷的能力。本发明首次在枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中通过特定突变该基因使得氨基酸序列发生改变，获得相应突变体可高效生产核苷，并成功创造出了能够高效生产核苷的微生物。

3、本发明的技术方案如下：

4、一种生产核苷及其相关衍生物的方法，其包括以重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生物相比于出发菌株，具有增强的海藻糖-6-磷酸水解酶活性。

5、海藻糖-6-磷酸水解酶活性的增强通过点突变导致的氨基酸变化，rbs强化，启动子强化和/或起始密码子强化实现，但不局限于上述强化方式；

6、优选，所述海藻糖-6-磷酸水解酶活性的增强通过使野生型海藻糖-6-磷酸水解酶的第196位甘氨酸和/或第441位丙氨酸被其他氨基酸取代实现。

7、更优选地，所述海藻糖-6-磷酸水解酶活性的增强通过使野生型海藻糖-6-磷酸水解酶的第196位甘氨酸被精氨酸取代和/或第441位丙氨酸被缬氨酸取代实现。

8、所述重组微生物表达海藻糖-6-磷酸水解酶突变体，所述海藻糖-6-磷酸水解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2、4、6、8中任一条所示。

9、所述出发菌株为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或大肠杆菌；

10、和/或，所述核苷为腺苷、肌苷和/或鸟苷，所述核苷的相关衍生物为三磷酸腺苷(atp)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷、肌苷酸、鸟苷酸、腺苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素或二乙酰鸟苷酸。

11、本发明还提供一种海藻糖-6-磷酸水解酶突变体，其以野生型海藻糖-6-磷酸水解酶的氨基酸序列为参考序列，所述海藻糖-6-磷酸水解酶突变体含有第196位甘氨酸和/或第441位丙氨酸被其他氨基酸取代的突变。

12、野生型海藻糖-6-磷酸水解酶的氨基酸序列在ncbi上的编号为np_388662.1。

13、优选，所述海藻糖-6-磷酸水解酶突变体含有第196位甘氨酸被精氨酸取代的突变和/或第441位丙氨酸被缬氨酸取代的突变；进一步优选，所述海藻糖-6-磷酸水解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2、4、6、8中任一条所示。

14、本发明再提供一种dna分子，其核苷酸如seq id no.1、3、5、7中任一条所示。

15、本发明另提供一种重组微生物，所述重组微生物表达上述海藻糖-6-磷酸水解酶突变体；

16、优选，所述重组微生物的出发菌株为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或大肠杆菌。

17、上述突变可应用于枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，但不限于上述两种菌株，也可将其应用于如短小芽孢杆菌、大肠杆菌等宿主菌，用于产肌苷、鸟苷、腺苷等核苷或对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等。

18、本发明另提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：

19、(1)在发酵生产核苷及其相关衍生物中的应用；

20、(2)在用于生产核苷及其相关衍生物的微生物遗传育种中的应用；

21、(3)在提高发酵生产核苷及其相关衍生物产量上的应用。

22、本发明的有益效果至少在于：

23、本发明通过将菌株细胞内编码海藻糖-6-磷酸水解酶的氨基酸序列发生特定变化，使得所述菌株产生核苷的能力与未修饰的菌株相比增强，提供了一种新的高效生产嘌呤核苷的方法。

24、具体地，突变菌株b.subtilis a0035(枯草芽孢杆菌中treag196r点突变菌株)、b.subtilis a0036(枯草芽孢杆菌中treaa441v点突变菌株)和b.subtilis a0037(枯草芽孢杆菌中treag196r,a441v点突变菌株)，较出发菌相比，腺苷产量分别由8g/l提高至8.6g/l、8.5g/l、9.2g/l。肌苷产量由1.0g/l分别提高至1.8g/l、2.2g/l、2.6g/l。而将一株鸟苷生产菌株中的trea进行点突变，分别获得改造菌b.a8395(解淀粉芽孢杆菌中treag196r点突变菌株)、b.a8396(解淀粉芽孢杆菌中treaa441v点突变菌株)和b.a8397(解淀粉芽孢杆菌中treag196r,a441v点突变菌株)，鸟苷产量由2g/l分别提高至2.8g/l、3.0g/l、3.2g/l；同时检测了该菌株产肌苷能力，其分别由0.6g/l提高至1.0g/l、1.3g/l、1.5g/l。