多特异性抗体及其制备和使用方法与流程

本公开一般涉及生物治疗，且更具体地涉及制备和使用多特异性抗体。

背景技术：

1、癌细胞发展各种策略以逃避免疫系统。免疫逃逸的潜在机制之一是免疫系统对癌细胞的识别降低。癌症特异性抗原的缺陷呈递或其缺乏导致免疫耐受和癌症进展。在有效的免疫识别的存在下，肿瘤使用其它机制以避免被免疫系统消除。免疫活性肿瘤产生抑制性微环境以下调免疫应答。多个参与者参与形成抑制性肿瘤微环境，包括肿瘤细胞、调节性t细胞、髓样衍生的抑制性细胞、基质细胞和其它细胞类型。通过从局部环境中分泌免疫抑制性细胞因子或消除必需的存活因子，免疫应答的抑制可以以细胞接触依赖性形式以及以接触非依赖性方式进行。细胞接触依赖性抑制依赖于细胞表面上表达的分子，例如，程序性死亡配体1(pd-l1)、t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)等[dunn等，2004，免疫(immunity)，21(2)：137-48；adachi和tamada，2015，cancer sci.，106(8)：945-50]。

2、随着肿瘤逃避免疫系统识别的机制继续被更好地了解，最近出现了靶向这些机制的新治疗方式。2011年3月25日，美国食品和药品管理局(fda)批准了用于治疗不可切除或转移性黑素瘤的易普利姆玛单抗注射剂(yervoy，bristol-myers squibb)。yrevoy与活化t细胞上表达的细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)结合并阻断抗原呈递细胞上ctla-4与cd80/86的相互作用，从而阻断通过ctla-4递送到t细胞中的阴性或抑制性信号，导致抗原特异性t细胞的再活化，这在许多患者中导致肿瘤的根除。2014年几年后，fda批准keytruda(派姆单抗(pembrolizumab)，默克公司)和opdivo(纳武单抗(nivolumab)，百时美施贵宝)用于治疗晚期黑素瘤。这些单克隆抗体结合在活化和/或耗尽的t细胞上表达的pd-1，并阻断pd-1与在肿瘤上表达的pd-l1的相互作用，从而消除通过pd-1进入t细胞的抑制信号，导致抗原特异性t细胞的再活化，这在许多患者中再次导致肿瘤的根除。从那时起，已经进行了另外的临床试验，将单一单克隆抗体yervoy与单克隆抗体yervoy和opdivo的组合在晚期黑素瘤的治疗中进行比较，晚期黑素瘤在用抗体组合治疗的患者中显示出总体存活和无进展存活的改善。(hodi等人，2016，柳叶刀·肿瘤学(lancet oncol).17(11):1558-1568，hellman等人，2018，肿瘤细胞(cancer cell)33(5)：853-861)。然而，由于许多临床试验已经显示出使用对一种或多种免疫检查点分子具有特异性的单克隆抗体治疗癌症患者的极大益处，数据已经显示出只有那些具有产生被抗原特异性t细胞识别的新t细胞表位的高突变负荷的患者显示出临床应答(snyder等人，2014，nejm371：2189-2199)。具有低肿瘤突变负荷的那些患者大部分不显示客观的临床反应(snyder等人，2014，nejm371：2189-2199，hellman等人，2018，肿瘤细胞(cancer cell)33(5)：853-861)。

3、近年来，其它团队已经开发了不需要存在通过抗原呈递细胞的新表位呈递来活化t细胞的替代方法。一个实例是双特异性抗体的开发，其中对肿瘤相关抗原如cd19特异的抗体的结合结构域与t细胞上cd3特异的抗体结合结构域连接，从而产生双特异性t细胞结合剂或咬合分子。在2014年，fda批准了称为博纳吐单抗(blinatumomab)的双特异性抗体用于治疗前体b细胞急性成淋巴细胞白血病。bl inatumomab将对白血病细胞上表达的cd19有特异性的scfv与对t细胞上表达的cd3有特异性的scfv连接起来(bejnijamin和stein 2016，ther adv hematol7(3)：142-146)。然而，尽管复发或顽固性急性淋巴细胞白血病(all)患者的初始应答率>50％，但许多患者在用blinatumomab成功治疗后对blinatumomab治疗有耐药性或复发。有证据表明，对blinatumomab的耐药性或blinatumomab治疗后的复发归因于在肿瘤细胞上表达的免疫检查点抑制分子的表达，如pd-l1，其通过在活化的t细胞上表达的pd-1驱动抑制信号(feucht等人，2016，肿瘤标靶(oncotarget7)(47)：76902-76919)。在对耐受blinatumomab治疗的患者的病例研究中，进行第二轮blinatumomab治疗，但加入对pd-1特异并阻断t细胞表达的pd-1与肿瘤细胞表达的pd-l1的相互作用的单克隆抗体pembrol izumab(keytruda，默克公司)，导致在这位患者中骨髓中肿瘤细胞的显著应答和从45％减少到小于5％(feucht等人，2016，oncotarget7(47)：76902-76919)。这些结果表明，与任一单独的试剂相比，将双特异性咬合分子与一种或多种单克隆抗体组合可显著增加临床活性。

技术实现思路

1、本公开尤其提供了四特异性抗体单体，含有四特异性单体的抗体，其抗原结合片段，多特异性抗体，包含所公开的抗体的免疫缀合物，制备所公开的单体、抗原结合片段和抗体的方法，以及使用所公开的分子治疗癌症的方法。

2、一方面，本技术提供了四特异性抗体单体。在一个实施方案中，具有n-末端和c-末端的四特异性抗体单体从n-末端到c-末端依次包含n-末端的第一scfv结构域、fab结构域、fc结构域、第二scfv结构域和c-末端的第三scfv结构域。第一scfv结构域、fab结构域、第二scfv结构域和第三scfv结构域各自具有针对不同抗原的结合特异性。

3、在一个实施方案中，抗原包括肿瘤抗原、免疫信号传导抗原或其组合。在一个实施方案中，第一scfv结构域、fab结构域、第二scfv结构域和第三scfv结构域各自具有针对肿瘤抗原或免疫信号传导抗原的结合特异性。在一个实施方案中，第一scfv结构域具有针对肿瘤抗原的结合特异性。在一个实施方案中，第一scfv结构域具有针对免疫信号抗原的结合特异性。在一个实施方案中，fab结构域具有针对肿瘤抗原的结合特异性。在一个实施方案中，fab结构域具有针对免疫信号抗原的结合特异性。在一个实施方案中，第二scfv结构域具有针对肿瘤抗原的结合特异性。在一个实施方案中，第二scfv结构域具有针对免疫信号抗原的结合特异性。在一个实施方案中，第三scfv结构域具有针对肿瘤抗原的结合特异性。在一个实施方案中，第三scfv结构域具有针对肿瘤抗原的结合特异性。

4、在一个实施方案中，四特异性单体包括scfv结构域、fab结构域、第二scfv结构域和第三scfv结构域，各自独立地具有针对抗原的结合特异性，所述抗原选自：ror1、pd-l1、cd3、cd28、4-1bb、cea、her2、egfr viii、egfr、lmp1、lmp2a、mesothelin、psma、epcam、glypimay-3、gpa33、gd2、trop2、nkg2d、bcma、cd19、cd20、cd33、cd123、cd22、cd30、pd-l1、pd1、ox40、4-1bb、gitr、tigit、tim-3、lag-3、ctla4、cd40、vista、icos、btla、light、hvem、csf1r、cd73和cd39。在一个实施方案中，scfv结构域、fab结构域、第二scfv结构域和第三scfv结构域各自独立地具有针对肿瘤特异性抗原的结合特异性，所述肿瘤特异性抗原包括但不限于ror1、cea、her2、egfr、egfr viii、lmp1、lmp2a、mesothelin、psma、epcam、glypimay-3、gpa33、gd2、trop2、bcma、cd3、cd19、cd20、cd33、cd123、cd22、cd30，或免疫检查点调节剂，包括但不限于pd-l1、pd1、ox40、4-1bb、gitr、tigit、tim-3、lag-3、ctla4、cd40、vista、icos、btla、light、hvem、cd73、cd39等。在一个实施例中，一组scfv结构域可以特异性结合免疫检查点调节剂或肿瘤抗原。在一个实施方案中，对cd3有特异性的scfv可以在重链或轻链的c或n末端。

5、在一个实施方案中，第一scfv结构域、fab结构域、第二scfv结构域和第三scfv结构域各自独立地具有针对选自cd3、egrf viii、pd-l1和4-1bb的抗原的结合特异性。在一个实施方案中，第一scfv结构域具有针对cd3的结合特异性。在一个实施方案中，fab结构域具有针对egrf viii的结合特异性。在一个实施方案中，第二scfv结构域具有针对pd-l1的结合特异性。在一个实施方案中，第三scfv结构域具有针对4-1bb的结合特异性。在一个实施方案中，第一scfv结构域具有针对cd3的结合特异性，fab结构域具有针对egrf viii的结合特异性，第二scfv结构域具有针对pd-l1的结合特异性，且第三scfv结构域具有针对4-1bb的结合特异性。

6、fc结构域可以是人源化的。在一个实施方案中，fc结构域是人igg1 fc。

7、scfv结构域可以包括将scfv结构域连接到抗体的重链或轻链的接头。在一个实施方案中，接头可以包括多于10个氨基酸。在一个实施方案中，接头可以包括超过15个氨基酸长。在一个实施方案中，接头可包括少于20个氨基酸。

8、在一个实施方案中，接头可以包含gly-gly-gly-gly-ser(g4s)n接头，且n可以是1-20的整数。例如，n可以是2、4或6。在一个实施方案中，第一scfv结构域、第二scfv结构域或第三scfv结构域可以包含gly-gly-gly-gly-ser(g4s)n接头，其中n是2或4。

9、在一个实施方案中，本技术提供了具有与以下氨基酸序列具有百分比同源性的氨基酸序列的四特异性抗体单体：seq id no.02、04、06、08、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58和60。所述同源性百分比不少于70％、80％、90％、95％、98％或99％。

10、本技术还提供了抗原结合片段。在一个实施方案中，本技术提供scfv结构域。在一个实施方案中，scfv结构域包括与以下氨基酸序列具有百分比同源性的氨基酸序列：seqid no.02、04、06、08、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58和60，其中同源性百分比不小于70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一个实施方案中，本技术提供fab结构域。在一个实施方案中，fab结构域包括与以下氨基酸序列具有百分比同源性的氨基酸序列：seq id no.02、04、06、08、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58和60，其中百分比同源性不小于70％、80％、90％、95％、98％或99％。本文公开的抗原结合片段可用于构建四特异性抗体单体或多特异性抗体。

11、一方面，本技术提供了多特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体包括四特异性抗体单体。在一个实施方案中，多特异性抗体包括本文公开的两种四特异性抗体单体。由于每个四特异性抗体单体具有四个抗原结合结构域，所公开的多特异性抗体可以包括8个抗原结合结构域。在一个实施方案中，这种多特异性抗体中的抗原结合结构域各自独立地具有针对不同抗原的结合特异性，从而提供八特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体是五特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体是五特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体是五特异性抗体、六特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体是五特异性抗体、七特异性抗体。

12、在一个实施方案中，多特异性抗体包括四特异性抗体单体的二聚体，从而提供四特异性抗体。在一个实施方案中，本技术提供分离的、纯化的或非天然存在的多特异性抗体。在一个实施方案中，本技术提供了具有与seq id no.66和68具有百分比同源性的氨基酸序列的四特异性抗体。百分比同源性不小于70％、80％、90％、95％、98％或99％。

13、本技术还提供了编码四特异性抗体单体、多特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸序列。在一个实施方案中，核酸编码与具有以下氨基酸序列的四特异性抗体单体具有百分比同源性的氨基酸序列：seq id no.01、03、05、07、09、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59。所述同源性百分比不小于70％、80％、90％、95％、98％或99％。

14、本技术还提供了包含本文公开的核酸序列的表达载体和宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞包括表达载体。所述宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。

15、本技术还提供了免疫缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物包括通过接头与本文公开的多特异性抗体连接的细胞毒性剂或显像剂。

16、接头可以是可切割的或不可切割的。接头可包括共价键，诸如酯键、醚键、酰胺键、二硫键、酰亚胺键、砜键、磷酸键、磷酸酯键、肽键或其组合。在一个实施方案中，接头包含疏水性聚(乙二醇)接头。

17、细胞毒性剂可包括化疗剂、生长抑制剂、来自卡利奇霉素(calicheamicin)类的细胞毒性剂、抗有丝分裂剂、毒素、放射性同位素、治疗剂或其组合。在一个实施方案中，细胞毒性剂选自卡利奇霉素、奥佐米星(ozogamicin)、单甲基澳瑞他汀e、美坦新(emtans ine)、其衍生物或组合。

18、成像剂可以是用于成像目的的任何化合物。在一个实施方案中，成像剂可以是放射性核素、荧光剂、量子点或其组合。

19、本技术还提供了药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和本文公开的四特异性抗体单体。在一个实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和本文公开的多特异性抗体。在一个实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和本文公开的抗原结合片段。在一个实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和本文公开的免疫缀合物。

20、在一个实施方案中，药物组合物还包括治疗剂。治疗剂的实例包括但不限于放射性同位素、放射性核素、毒素、化疗剂或其组合。在一个实施方案中，治疗剂包含抗体、酶或其组合。在一个实施方案中，治疗剂包括抗雌激素剂，受体酪氨酸激酶抑制剂，激酶抑制剂，细胞周期抑制剂，dna、rna或蛋白质合成抑制剂，ras抑制剂或其组合。在一个实施方案中，治疗剂包含检查点抑制剂。在一个实施方案中，治疗剂包括以下的的抑制剂：pd1、pdl1、ctla4、4-1bb、ox40、gitr、icos、light、tim3、lag3、tigit、cd40、cd27、hvem、btla、vista、b7h4、csf1r、nkg2d、cd73、其衍生物或组合。

21、在另一方面，本技术提供了制备四特异性抗体单体、多特异性抗体、其抗原结合片段及其免疫缀合物的方法。

22、在一个实施方案中，所述方法包括培养含有本文公开的核酸序列的宿主细胞以便表达编码抗体的dna序列以及纯化抗体的步骤。在一个实施方案中，抗体是三特异性抗体。

23、在另一方面，本技术提供了将四特异性抗体单体、多特异性抗体、其抗原结合片段及其免疫缀合物用于癌症治疗的方法。在一个实施方案中，该方法包括将四特异性抗体单体、多特异性抗体、其抗原结合片段、及其免疫缀合物、或其药物组合物施用给需要这种治疗的受试者的步骤。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的四特异性抗体的步骤。

24、在一个实施方案中，该方法包括直接向肿瘤部位注射有效量的多特异性单体、多特异性抗体、免疫缀合物、其抗原结合片段。

25、可以预防或治疗多种癌症。在一个实施方案中，癌症可以具有表达ror1、cea、her2、egfr、egfr viii、lmp1、lmp2a、间皮素、psma、epcam、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gpa33、gd2、trop2、nkg2d、bcma、cd19、cd20、cd33、cd123、cd22或cd30的细胞。癌症的实例包括不限于乳腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、头颈癌、鼻咽癌、皮肤癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、尿道癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、脑肿瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、食道癌、胃癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、眼癌、肉瘤、骨癌、白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。

26、在一个实施方案中，该方法可以进一步包括共同施用有效量的治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂包括抗体、化疗剂、酶或其组合。在一个实施方案中，治疗剂包括抗雌激素剂，受体酪氨酸激酶抑制剂，激酶抑制剂，细胞周期抑制剂，dna、rna或蛋白质合成抑制剂，ras抑制剂或其组合。在一个实施方案中，治疗剂可以包括检查点抑制剂。在一个实施方案中，治疗剂包括pd1、pd-l1、ctla4、4-1bb、ox40、gitr、icos、light、tim3、lag3、tigit、cd40、cd27、hvem、btla、vista、b7h4、csf1r、nkg2d、cd73、衍生物或其组合的抑制剂。

27、在一个实施方案中，治疗剂可包括卡培他滨、顺铂、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿霉素、环磷酰胺、氮芥、长春新碱、丙卡巴肼、泼尼松龙、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊苷、表柔比星、培美曲塞、叶酸、吉西他滨、奥沙利铂、伊立替康、托泊替康、喜树碱、多西他赛、紫杉醇、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、睾内酯、伏氯唑、福美司坦、法倔唑、埃罗替尼、拉法替尼、达沙替尼、吉非替尼、奥西美替尼、范德坦尼、阿法替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、拉帕替尼、舒尼替尼、尼洛替尼、索拉非尼、nab-帕拉他赛、依维莫司、替西罗莫司、达拉非尼、维莫拉非尼、曲美替尼、长春他叶酸、阿帕替尼、克立唑替尼、哌福辛(periforsine)、奥拉帕利、硼替佐米、托法替尼、曲妥珠单抗、其衍生物或组合。

28、受试者可以是人。在一个实施方案中，受试者可能患有癌症。本技术还提供了包含有效浓度的本文公开的多特异性抗体、单体或免疫缀合物的溶液。在一个实施方案中，溶液是受试者的血浆。

29、通过以下结合附图对本发明的示例性实施例的详细描述，本发明的目的和优点将变得显而易见。从下面的详细描述中，其它实施例对于本领域技术人员来说是显而易见的，其中通过说明预期的最佳模式来描述实施例。可以认识到，其它和不同的实施例是可能的，并且实施例的若干细节能够在各种显而易见的方面进行修改，所有这些都不脱离它们的精神和范围。因此，附图和详细描述应被认为本质上是说明性的而非限制性的。